SN38對Fas介導凋亡效應的影響

曹妍，王歡，童曉鵬，單風平，梅原久範，呂昌龍*

(1.中國醫科大學基礎醫學院免疫學教研室，遼寧沈陽110001;2.西藏民族學院免疫學教研室，陜西咸陽712000;3.金沢醫科大學血液免疫內科，日本金沢920-0293)

細胞凋亡是在多種基因調控下的一個嚴密完整的、主動的、有序的死亡過程。Fas(CD95/APO-1)是TNF受體超家族成員，通過與Fas配體(FasL)或者抗Fas抗體(CH11)結合，誘導Fas分子聚集形成三聚體，通過其胞漿內的死亡結構域(death domain，DD)與Fas相關的死亡結構蛋白(Fas-associated death domain protein，FADD)結合，形成死亡受體誘導的信號復合體(DISC)，DISC可以活化caspase分子介導細胞凋亡［1］。伊立替康(Irinotecan)，也稱為CPT-11，通過抑制拓撲異構酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ，TopoⅠ)選擇性殺傷S期細胞。SN38(10-hydroxy-7-ethyl-camptothe-cin)是CPT-11的活性代謝產物，其作用強度至少是CPT-11的1 000倍，并且具有廣泛的抗腫瘤譜［2-3］。脂筏是細胞膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結構域(microdomain)。鞘磷脂(sphingomyelin，SM)是脂筏的重要組成成分。最近的一些研究表明，Fas介導的凋亡過程中，Fas可易位和聚集于脂筏所在區域［4］，脂筏通過促進DISC的形成進而活化caspase依賴的細胞死亡途徑。因此為深入探討SN38與Fas介導凋亡的相互關系，本實驗通過單獨應用SN38或SN38聯合CH11(Fas抗體)作用于脂筏陰性和脂筏陽性的T細胞淋巴瘤細胞株WR/Fas-SM(-)細胞和WR/Fas-SMS1細胞，觀察SN38能否促進Fas介導的凋亡以及對2種細胞的效應差異，并進一步探討脂筏在該過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞WR/Fas-SMS1細胞和WR/Fas-SM(-)細胞［5］由日本金沢醫科大學血液免疫內科提供。

1.1.2 主要試劑二甲基亞砜(DMSO，SIGMAALDRICH);0.4%臺盼藍(Gibco);碘化丙啶(PI，Invitrogen);多聚甲醛;皂甙;瓊脂糖(TAKARA);RPMI-1640培養液500 mL(Gibco，Invitrogen);CH11(Medical＆Biological Laboratories，Japan);Genelute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit(Sigma);SN38(Yakult pharmaceutical，Japan)。

1.1.3 主要儀器流式細胞儀，FACSCalibur，美國BD公司;CO2細胞孵育箱，WJ-3，日本Harasawa;倒置顯微鏡，日本Olympus。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養WR/Fas-SM(-)細胞和WR/Fas-SMS1細胞常規復蘇后，培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的1640培養液中，于5%CO2，37℃培養箱內常規傳代培養。

1.2.2 細胞處理常規收集并且計數細胞，調整細胞濃度為5×105/mL，接種24孔板，每孔1 mL。CO2細胞孵育箱中培養2 h后，分別加入不同濃度SN38和/或CH11刺激，混勻細胞后，放入CO2細胞孵育箱中繼續培養。

1.2.3 形態學觀察刺激細胞12 h后，于倒置顯微鏡下觀察，并于放大400倍時拍照記錄。

1.2.4 FACS檢測細胞凋亡分別收集24孔板中處理后的WR/Fas-SM(-)細胞和WR/Fas-SMS1細胞于1.5 mL微量離心管中，1 200 r/min離心3 min，棄上清，每管加0.5%PFS(0.5%多聚甲醛，0.5%皂甙)100 μL，再加入150 μg/mL RNase A 50 μL。室溫放置30 min后，每管加入1 mL PBS，混勻后，1 200 r/min離心3 min，棄上清，每管留50 μL液體，再加入200 μg/mL PI 5 μL，混勻后避光放置15 min。再于每管加入500 μL PBS，待流式細胞儀檢測。

1.2.5 DNA ladder檢測按照Sigma Genelute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit說明書操作。經1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.2.6 統計學分析應用SPSS11.5統計學分析軟件，用t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 SN38對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1凋亡的影響

WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1經過不同濃度SN38刺激12 h后，與對照組相比不同濃度SN38均誘導了2種細胞的凋亡現象發生，但在各濃度組，2種細胞之間的凋亡率并無顯著性差異，見圖1。

2.2 CH11對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1凋亡的影響

WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1經過不同濃度CH11刺激3 h后，50 ng/mL CH11可誘導WR/Fas-SM(-)細胞有意義的凋亡現象，但凋亡率較低;而在25 ng/mL和50 ng/mL 2個濃度組均誘導了WR/Fas-SMS1細胞有統計學意義的凋亡現象，并且在2個濃度組，2細胞之間的凋亡率存在顯著性差異，見圖2。

圖2 CH11作用WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1后凋亡率的比較Fig.2 Comparision of apoptosis between WR/Fas-SM(-)and WR/Fas-SMS1 cultured with CH11

2.3 SN38和CH11共同作用對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1凋亡的影響

圖3 SN38單獨及與CH11聯合應用對WR/Fas-SM(－)細胞凋亡率的影響比較Fig.3 Comparision of apoptosis of WR/FAS-SM(-)cultured with CH11 and/or SN38

SN38和CH11聯合應用與SN38單獨應用各濃度組相比，WR/Fas-SM(-)細胞凋亡率未見顯著性差異(見圖3);但對WR/Fas-SMS1細胞，在SN38 50 nmol/L濃度組出現凋亡率的差異(見圖4)，并且在該濃度組，2種細胞之間的凋亡率出現了顯著性差異(見圖5)。

圖4 SN38單獨及與CH11聯合應用對WR/Fas-SMS1細胞凋亡率的影響比較Fig.4 Comparision of apoptosis of WR/Fas-SMS1 cultured with CH11 and/or SN38

圖5 SN38和CH11共同作用對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1凋亡率的影響比較Fig.5 Comparision of apoptosis between WR/Fas-SM(-)and WR/Fas-SMS1 cultured with CH11 and SN38

2.4 SN38和CH11共同作用后WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1的形態學改變

WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1經過SN38和CH11刺激12 h后均出現比較明顯的凋亡現象，并且WR/Fas-SMS1細胞的凋亡細胞數量明顯多于WR/Fas-SM(-)細胞，見圖6(圖中箭頭所指為凋亡細胞)。

圖6 SN38和CH11共同作用對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1的形態學改變(400×)Fig.6 Morphological changes of WR/Fas-SM(-)and WR/Fas-SMS1 after SN38 and CH11 stimulation(400×)

2.5 SN38和CH11共同作用對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1 DNA降解的影響

WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1經過SN38和CH11刺激12 h后，DNA提取結果經1.5%瓊脂糖凝膠電泳的結果表明2種細胞都出現了DNA的斷裂片段呈梯狀(DNA ladder)排列，并且WR/Fas-SMS1細胞DNA的斷裂程度明顯強于WR/Fas-SM(-)細胞，見圖7。

圖7 SN38和CH11共同作用對WR/Fas-SM(－)和WR/Fas-SMS1 DNA降解的影響Fig.7 Degradation of chromosomal DNA in WR/Fas-SM(-)and WR/Fas-SMS1 after SN38 and CH11 stimulation

3 討論

本實驗結果顯示，聯合應用SN38和CH11與單獨應用SN38或CH11相比，能夠誘導WR/Fas-SMS1細胞更強的凋亡。該結果表明化療藥SN38與CH11聯合使用在誘導細胞凋亡作用中具有疊加效應。

脂筏是細胞膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結構域，參與細胞膜的轉運、信號傳導過程［6］。信號分子(如受體)將在脂筏中與它們的配體相遇，啟動信號傳遞途徑［7-8］。目前已經發現，脂筏參與了免疫突觸的形成［9］，巨噬細胞的內吞作用［10］，老年癡呆病中淀粉樣蛋白的產生［11］等一系列生理和病理過程。鞘磷脂是脂筏的重要組成成分。目前，人們已經成功克隆了2種編碼SMS的基因，分別為SMS1和SMS2。本實驗中所應用的WR/Fas-SM(-)和WR/Fas-SMS1細胞分別是SMS1缺陷和表達的2株細胞，進而形成了細胞膜脂筏陰性和陽性的2種細胞。最近的一些實驗表明，脂筏參與了Fas介導的凋亡過程，尤其是在多發性骨髓瘤［12］和淋巴瘤［13］的發病過程中。

單獨應用不同濃度SN38作用于WR/Fas-SM(-)細胞和WR/Fas-SMS1細胞后，各濃度組的凋亡率在2種細胞間均未見顯著性差異，且在50 nmol/L濃度的SN38刺激時，相比25 nmol/L濃度并不能誘導出更高的凋亡率;而在SN38與25 ng/mL的CH11共同作用于2種細胞后，觀察到在SN38為50 nmol/L時明顯誘導了WR/Fas-SMS1細胞更高的凋亡率，而對WR/Fas-SM(-)細胞相同的處理后，并沒有該現象的發生。隨后的形態學觀察和DNA Ladder的實驗結果也更加證實了這個結論。由于WR/Fas-SMS1細胞含有人為轉入的SMS1基因，因此該細胞膜表面表達SM，而對于WR/Fas-SM(-)細胞，由于SM缺陷，導致細胞膜脂筏功能的缺陷或低下。又由于脂筏參與Fas介導凋亡過程，即參與了Fas與配體結合后，信號向內部的傳遞［14］，甚至有些實驗表明，在細胞膜存在脂筏的情況下，Fas可以在沒有Fas配體與其結合的情況下介導細胞凋亡［15］?；谝陨辖Y果，可推測脂筏在SN38和CH11共同作用后，2種細胞凋亡率的顯著差異中起到了決定性的作用。

綜上，SN38和CH11的共同應用能促進WR/Fas-SMS1細胞的凋亡，顯示了SN38和CH11在誘導凋亡方面的協同作用。同時，SN38和CH11的共同應用對WR/Fas-SM(-)細胞凋亡的促進不明顯，推測脂筏在SN38促進WR/Fas-SMS1細胞Fas介導凋亡作用中起到一定作用。

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