甘草甜素對樹突狀細胞表型及生物學功能的影響

于洪濤，華慧，李偉偉，孟一鳴，李璇，張朕杰，單風平

(中國醫科大學免疫學教研室，遼寧沈陽110001)

樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是功能最強的專職抗原提呈細胞，能有效刺激初始型T細胞的增殖，是機體免疫反應的始動者，參與機體多種自身免疫性疾病、免疫缺陷病、腫瘤及一些炎癥反應的病理過程，在機體抗感染免疫及腫瘤應答免疫中起重要作用［1-2］。甘草甜素(glycyrrhizin，GL)是中藥甘草的主要成分，具有免疫調節、抗炎、抗病毒、抗變態反應等作用，現運用于臨床各種疾病的治療，取得了明顯確切的療效［3-4］。鑒于甘草甜素和樹突狀細胞在免疫系統中的顯著地位，本實驗就甘草甜素對小鼠髓系DC2.4細胞株表型及功能的調節作用進行研究，并探討其免疫刺激功能及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 來源DC來源為C57小鼠髓系DC2.4細胞株，本教研室保存并傳代。

1.1.2 藥物與主要試劑甘草甜素，美國Sigma公司;IL-12 ELISA試劑盒，eBioscience;PE-MHCⅡ抗體、PE-CD86抗體、FITC-CD40抗體，BD Biosciences;酸性磷酸酶試劑盒，南京建成科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠髓系樹突細胞2.4(DC2.4)復蘇和培養取出凍存的DC2.4細胞，迅速放入37℃水浴中，不斷地攪動直到凍存管中的細胞溶化。1 000 r/min離心10 min，棄上清，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液柔和地吹打，直到完全散開。將吹打后的液體轉移到準備好的培養瓶(含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液)中，于倒置顯微鏡下觀察細胞狀態后，放到溫度37℃、5%CO2的培養箱中培養。

1.2.2 藥物處理甘草甜素溶解于RPMI 1640中，加入培養至對數生長期的DC細胞培養液中，甘草甜素濃度為12.5 μg/mL(預實驗發現此濃度效果最好)，RPMI 1640作為陰性對照，LPS(10 ng/L)作為陽性對照。①掃描電鏡觀察DC表面形態：按照上述藥物處理方法培養DC，48 h后收集細胞，經過常規掃描電鏡制樣流程：戊二醛固定、清洗、鋨酸后固定、清洗、置換、臨界點干燥、粘臺、噴金，最后在掃描電鏡(JEOL.JSM-7300)下觀察;②流式細胞儀檢測DC表面分子：藥物處理過的細胞經48 h培養后，用胰酶消化為細胞懸液，用FASC緩沖液(含2%FCS的PBS)洗2遍，1 000 r/min離心10 min，調整細胞濃度為1×107個/mL，每管加0.1 mL細胞懸液，加PE標記的MHCⅡ和CD86(BD Biosciences)，FITC標記的CD40(BD Biosciences)單克隆抗體，4℃下溫育30 min，FACS緩沖液洗2遍，然后用300 μL FACS緩沖液重懸細胞置于流式細胞儀(FACS Cabulir BD)上檢測;③體外刺激淋巴細胞增殖實驗：取1×106/mL DC細胞懸液作為刺激細胞，同時無菌取C57小鼠脾淋巴細胞4×107/mL作為反應細胞。于96孔培養板每孔加入刺激細胞和反應細胞各100 μL，并設反應細胞自身對照。置37℃、5%的CO2培養箱孵育48 h。在培養結束前4 h于每孔加入20 μL MTT試劑，繼續培養4 h。培養結束后用酶標儀讀570 nm處的吸光度值;④4-氨基安替比林(4-AAP)比色檢測DC內酸性磷酸酶活性：DC經藥物處理后培養48 h，再用胰酶消化成細胞懸液，調整細胞濃度為1×106個/mL，按照測酸性磷酸酶試劑盒(南方建成生物工程研究所)提供方法操作;⑤ELISA檢測培養上清中IL-12的分泌：DC經甘草甜素和LPS作用48 h后收集上清，應用雙抗體夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞培養上清中IL-12的含量，試驗按照購買的ELISA試劑盒(eBioscience)的步驟操作。反應終止后用酶標儀檢測450 nm處吸光值(A450)，再根據標準曲線確定所測細胞因子的濃度。

1.2.3 統計學分析采用SPSS16.0統計軟件進行分析，計量資料以ˉχ±s表示，多樣本均數比較應用單因素方差分析(One-way ANOVA)，樣本均數間的多重比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 掃描電鏡觀察DC表面形態

DC經藥物刺激48 h，按照材料與方法中所述的制樣步驟處理后，在掃描電鏡下觀察其表面形態。如圖1所示，甘草甜素處理后的DC形態不規則，表面粗糙，有層疊狀的皺襞，細胞表面有長短不等的大量的樹枝樣突起，此外尚有短小的圓形、橢圓形突起，而陰性對照組DC細胞突起顯著減少，層疊不明顯。

2.2 甘草甜素對DC表面MHCⅡ、CD86、CD40表達的影響

DC高表達MHCⅡ、CD86、CD40是DC趨向成熟的標志之一［2，5-6］。與陰性對照組(RPMI 1640)相比，12.5 μg/mL甘草甜素與LPS類似，能夠上調MHCⅡ、CD86、CD40的表達(P＜0.05)，即甘草甜素與LPS相似均能夠促進DC的成熟(圖2)。

圖1 DC的掃描電鏡圖片Fig.1 Scanning eledtronic microscopy for DCs’morphology

圖2 甘草甜素能夠上調DC表面MHCⅡ、CD40、CD86的表達Fig.2 Up-regulation of the expressiong of MHCⅡ、CD40 and CD86 on the DCs after treatment with GL

2.3 甘草甜素對DC刺激T淋巴細胞增殖的影響

DC刺激同種異體小鼠脾臟T淋巴細胞增殖反應的程度用A值(A570)表示。與對照組相比，甘草甜素組和LPS組刺激同種異體小鼠脾臟T淋巴細胞增殖能力均明顯增強(P＜0.05，表1)。

2.4 甘草甜素對酸性磷酸酶活性的影響

酸性磷酸酶是溶酶體內主要的效應酶，酸性磷酸酶含量的下降說明溶酶體含量的減少，間接說明DC吞噬加工抗原的能力減弱，細胞趨向成熟。用甘草甜素刺激DC2.4 48 h后，與陰性對照組相比，甘草甜素組和LPS組酸性磷酸酶活性均下降(表2)。

表1 甘草甜素增強同種異體小鼠脾臟T淋巴細胞增殖(A570)(±s，n=6)Table 1 GL enhance the proliferation of allogenic spleen T lymphocytes(A570)(±s，n=6)

表1 甘草甜素增強同種異體小鼠脾臟T淋巴細胞增殖(A570)(±s，n=6)Table 1 GL enhance the proliferation of allogenic spleen T lymphocytes(A570)(±s，n=6)

GroupA570P RPMI 16401.48±0.07 LPS2.33±0.11＜0.01 GL1.56±0.05＜0.05

表2 甘草甜素下調酸性磷酸酶活性(A520)(±s，n=6)Table 2 GL enhance the activity of acid phophatase(A520)(±s，n=6)

表2 甘草甜素下調酸性磷酸酶活性(A520)(±s，n=6)Table 2 GL enhance the activity of acid phophatase(A520)(±s，n=6)

GroupA520P RPMI 16400.53±0.01 LPS0.44±0.03＜0.01 GL0.48±0.01＜0.05

2.5 ELISA檢測培養細胞上清液IL-12含量

圖3 甘草甜素能夠增強DC對IL-12的分泌Fig.3 GL can enhance the ability of DC to secrete IL-12

IL-12是DC受刺激后比較特異的一種產物［7-8］。根據標準品濃度制定標準曲線(方程y=0.002 7x+0.060 3(R2=0.999 2))，與RPMI 1640組相比，甘草甜素處理的DC能夠增加DC培養液上清中IL-12的含量，LPS作為陽性對照。ELISA結果顯示DC在未做任何處理時(即RPMI 1640組)IL-12分泌量少((254.83±8.31)pg/mL)，甘草甜素和LPS處理的DC能夠分泌較高水平的lL-12(分別為(284.17±9.52)pg/mL、(306.67±8.75)pg/mL)，結果顯示甘草甜素與LPS類似，能夠促進DC功能的成熟(圖3)。

3 討論

甘草甜素具有調節細胞因子功能，糾正Th1/Th2比例失衡的作用，主要通過抑制前列腺素合成的限速酶—磷脂酶A2的活性，減少前列腺素的產生，并誘導IL-1的產生，從而促進IL-2的產生，促進INF-γ的分泌，同時可能抑制IL-4的產生，從而使Th1的功能增強，抑制Th2的功能，調節Th1/Th2失衡［9-10］。DC最大的特點是能夠顯著刺激初始型T細胞(naive T cells)增殖，因此DC是機體免疫反應的始動者，在誘導免疫應答過程中具有獨特的地位。DC在體內廣泛分布，是一種異質性細胞群體，具有多種不同形態、表型和功能。正常情況下絕大多數體內DC處于非成熟狀態，不成熟的樹突狀細胞(immature dendritic cells，iDC)具有高效的抗原攝取和處理能力，因其低表達共刺激分子和主要組織相容復合體(major histocompatibility complex，MHC)分子，對T細胞的激活作用差，故其抗原提呈能力較弱。未成熟DC在攝取抗原或接受到某些刺激因素(如LPS、TNF-α)后，細胞表面MHC-Ⅱ分子和協同刺激分子如CD40、CD80/CD86、CD58表達增加，呈遞抗原的能力逐漸增強，而攝取、加工處理抗原的能力逐漸減弱，并同時向淋巴器官遷移，逐漸分化成熟，增殖并分泌多種細胞因子，最終發育為成熟樹突狀細胞(mature dendriticcells，mDC)［5］。本實驗應用的DC2.4細胞株是首先將GM-CSF轉染C57BL/6小鼠骨髓培養細胞，然后再轉染myc和raf癌基因而建立的永生化細胞株［11］。DC2.4具有很強的吞噬功能，是一種標準的用于DC研究用的未成熟的細胞系，目前多用于抗腫瘤的免疫治療。

DC的免疫功能有賴于其表面免疫分子的表達情況，DC對抗原多肽的提呈除需MHCⅡ類分子的參與外，T細胞的激活還需要其表面所表達的共刺激分子、黏附分子的參與。本實驗研究了濃度為12.5 μg/mL的甘草甜素對DC2.4表型和功能的影響，研究結果表明，甘草甜素刺激后的樹突狀細胞形態不規則，表面粗糙，有層疊狀的皺襞，細胞表面有長短不等的大量樹枝樣突起，細胞表面高表達MHCⅡ、CD86、CD40分子，且DC激活T細胞能力及T細胞增殖能力增強，提示甘草甜素通過促進DC膜免疫分子的表達進而明顯提高DC抗原的提呈功能。此外，本研究還發現12.5 μg/mL的甘草甜素降低了細胞內酸性磷酸酶的活性，酸性磷酸酶是溶酶體內主要的效應酶，酸性磷酸酶含量的下降說明溶酶體含量的減少，間接說明DC吞噬抗原的能力減弱，遞呈能力加強，細胞趨向成熟。包括DC在內的許多免疫細胞可分泌IL-12因子，主要作用于T細胞和NK細胞，參與調節細胞免疫應答，DC在非刺激狀態即可產生IL-12，在受到細菌、病毒或其自身表面分子的配體的刺激下分泌更明顯［12］。IL-12還有強大的誘生干擾素的作用，故DC可通過IL-12介導Th1型免疫反應，從而促進細胞免疫應答，本實驗經檢測DC的培養上清中IL-12的含量，發現甘草甜素能夠促進IL-12的表達。IL-12是DC的功能性產物，其含量的增高以及抗原提呈方面的成熟和形態學上的成熟是對應的，IL-12含量的增加可以進一步促進CD4+T細胞增殖，增強CTL殺傷活性，刺激T細胞和NK細胞產生INF-γ，抑制IgE合成。

甘草甜素是從中藥甘草提取的有效成分，具有免疫調節的作用。本實驗應用甘草甜素體外對DC2.4細胞株誘導培養出了表達成熟免疫表型的DC，并具有顯著的刺激T細胞增殖的作用，可特異性激活T細胞，同時可促進DC功能性產物IL-12表達的增高。研究結果不僅為今后DC的誘導提供了一條經濟便捷的途徑，而且為甘草甜素免疫治療提供了理論依據。

［1］ Steinman RM.The dendritic cell system and its role in immunogenic-city［J］.Annu Rev Immunol，1991，(9)：271-296.

［2］ Banchereau J.，Steinman RM.Dendritic cell and the control of immunity［J］.Nature，1998，392(6673)：271-296.

［3］ Chung WT，Lee SH，Kim JD，et al.Effect of the extracts from Glycyrrhiza uralensis Fisch on the growth characteristics of human cell lines：Anti-tumor and immune activation activities［J］.Cytotechnology，2001，37(1)：55-64.

［4］ Ashfaq UA，Masoud MS，Nawaz Z，et al.Glycyrrhizin as antiviral agent against Hepatitis C Virus［J］.J Transl Med，2011，(9)：112.

［5］ Bancherau J，Briere F，Caux C，et al.Immunobiology of dendritic cells［J］.Ann Rev Immunol，2000，18：767-811.

［6］ Liu YJ.Dendritic cell subsets and lineages，and their functions in innate and adaptive immunity［J］.Cell，2001，106(3)：259-262.

［7］ Mosca PJ，Hobeika AC，Clay TM，et al.A subset of human monocyte-derived dendritic cells expresses high level of interleukin-12 in response to combined CD40 ligand and interferongamma treatment［J］.Blood，2000，96(10)：3499-3504.

［8］ Lapointe R，Toso JF，Butts C，et al.Human dendritic cells require multiple activation signals for the efficient generation of tumor antigen-specific T lymphocytes［J］.Eur J Immnol，2000，30(11)：3291-3298.

［9］ Nakajima N，Utsanomiya T，Kobayashi M，et al.In vitroinduction of anti-type 2 T cells by glycyrrhizin［J］.Burns，1996，22(8)：612-617.

［10］ Yoshikawa M，Matsui Y，Kawamoto H，et al.Effects of glycyrrhi-zin on immune-mediated cytotoxicity［J］.J Gastroenterol Hepatol，1997，12(3)：243-248.

［11］ Shen Z，Reznikoff G，Dranoff G，et al.Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and II molecules［J］.J Immunol，1997，158(6)：2723-2730.

［12］ Lutz MB，Assmann CU，Girolomoni G，et al.Dif-ferent cytokines regulate antigen uptake and presentation of a precursor dendritic cell line［J］.Eur.J Immunol，1996，26(3)：586-594.