富含蛋氨酸玉米醇溶蛋白在枯草芽胞桿菌中的表達

婁麗，高學軍，敖金霞

(東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

益生菌是近年來開發(fā)的一種新型飼料添加劑，在畜禽生產中具有廣闊的應用前景［1］。對畜禽而言，飼料的營養(yǎng)價值是由必需氨基酸決定的，其中最重要的是蛋氨酸。如果缺乏蛋氨酸，可導致產奶量降低等。當前國內外對枯草芽胞桿菌研究并不多，但是大多數(shù)研究者對枯草芽胞桿菌的作用效果表示認可。枯草芽胞桿菌做為益生菌之一，已廣泛用于生產，它比其他益生菌具有更多的優(yōu)點，有增進畜禽生長性能，又有較強的抗性，在飼料制粒和儲存過程以及在胃腸道中作用穩(wěn)定并保持較高活性［2］。玉米胚乳中玉米醇溶蛋白(zein)是天然存在的穩(wěn)定型蛋白，含有20%的蛋氨酸。由于它富含蛋氨酸的特點，在國際上廣泛應用，已經(jīng)在許多轉基因植物例如轉基因大麥中［3-4］成功表達，并提高了蛋氨酸含量。高蛋氨酸蛋白基因在微生物中，尤其是在枯草芽胞桿菌中是否可以表達，尚未見報道。本實驗研究zein基因在枯草芽胞桿菌中表達，為制備富含蛋氨酸枯草芽胞桿菌進一步應用于飼料生產提供工作基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料Bacillus subtili WB600、玉米種子(農大108)由本實驗室保存。

1.1.2 試劑E.coli TOP10、RNAiso-mate for Plant Tissue、Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性內切酶、T4 DNA連接酶、蛋白質Marker、SmaⅠ、XbaⅠ、DNA marker購自大連寶生物科技有限公司;氨芐青霉素、氯霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自上海生工生物工程公司;膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、枯草芽胞桿菌表達載體pHT43購自Axygen公司;引物由北京英俊公司合成;其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 玉米胚乳中總RNA的提取反轉錄成cDNA。用Trizol法提取玉米胚乳中的總RNA。cDNA的合成采用試劑盒方法(見寶生物Prime-Script RT-PCR Kit說明書)。

1.2.2 zein的PCR擴增根據(jù)NCBI上zein的cDNA全序列設計引物［5］，為方便連接，在上游引物5'端添加XbaⅠ酶切位點，在下游引物5'端添加SmaⅠ酶切位點。上游引物：5'-TCTAGAAG GAAGCAAGGACACCACC-3'，下游引物：5'-CCCGGGTCTAGAATGCAGCACCAAC-3'。以cDNA為模板進行PCR反應，反應條件：95℃，5 min;94℃，1 min;56.5℃，30 s;72℃，30 s;72℃，7 min。擴增完畢后，取5 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR結果。

1.2.3 zein基因的克隆和序列測定將PCR擴增產物連接到pMD18-T simple載體上，轉化大腸埃希菌TOP10感受態(tài)中，經(jīng)氨芐篩選后，提取質粒，通過PCR鑒定，篩選陽性克隆子，將陽性克隆子進行核苷酸序列測定(由北京英俊公司完成)，用生物信息學軟件將所得序列和NCBI發(fā)布的序列進行比對分析。

1.2.4 枯草芽胞桿菌中重組表達質粒的構建以及轉化用XbaⅠ/SmaⅠ雙酶切PCR擴增片段并從膠中回收，然后用T4連接酶與同樣雙酶切后膠回收的pHT43連接，構建成重組表達載體pHT43-zein。通過電轉化方法將重組表達質粒轉入Bacillus subtilis WB600中［6］。LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，氯霉素篩選。

1.2.5 枯草芽胞桿菌中重組表達質粒pHT43-zein的鑒定挑取單菌落于5 mL LB+氯霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質粒［7］，用SmaⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，篩選陽性克隆子。

1.2.6 pHT43-zein在枯草芽胞桿菌的表達將攜帶重組表達質粒pHT43-zein的枯草芽胞桿菌在含有氯霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD值為0.5～1.0之間時，加入0.8 mmol/L的IPTG，誘導24 h后，制取蛋白樣，然后進行SDS-PAGE電泳，其濃縮膠濃度為5%，電泳時電壓為80 V，分離膠濃度為12%，電壓為110 V。電泳結束后，用固定液固定蛋白膠30 min，用考馬斯亮藍進行染色，經(jīng)脫色液脫色后觀察表達后產物條帶。

1.2.7 HPLC檢測菌液中蛋氨酸含量測定菌株中總蛋氨酸含量，取菌體8 mL，按照GB/T 18246-2000中酸水解法進行水解后，定容至50 mL。吸取1 mL濾液，分別置于50 mL離心管中，再分別吸取Na2CO3-NaHCO3pH 9.0緩沖液2 mL，混勻后，加入CDNB溶液各2 mL，混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，取10 μL直接上樣測定其中蛋氨酸含量。

2 結果與分析

2.1 玉米醇溶蛋白(zein)基因序列的獲得

擴增出zein目的片段見圖1，在500 bp處出現(xiàn)目的帶，與預期的大小相符，經(jīng)測序該片段全長476 bp與NCBI報道序列進行Blast分析，同源性達到了99%，在157、430位置處出現(xiàn)了錯配。

圖1 玉米醇溶蛋白基因的PCR產物電泳圖譜Fig.1 PCR products of zein gene of Psophocarpus tetragonolobus

2.2 枯草芽胞桿菌中重組表達載體的構建和鑒定

重組質粒pHT43-zein，片段長為8 524 bp，見圖2。將重組質粒轉化到枯草芽胞桿菌中，提取陽性克隆子，進行雙酶切鑒定，如圖3，在500 bp出現(xiàn)條帶，條帶大小符合預測值，證明重組表達載體的質粒已經(jīng)成功轉入到枯草芽胞桿菌中。

2.3 目的蛋白的SDS-PAGE鑒定

圖4 蛋白電泳檢驗枯草芽胞桿菌中的目的蛋白Fig.4 SDS-PAGE detection of zein in Bacillus subtilis

將未誘導、誘導的含空載體pHT43的重組菌和含重組質粒的重組菌按5%(體積比)分別接種于100 mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(含氯霉素)中，37℃200 r/min振蕩培養(yǎng)4 h后，加入終濃度0.8%的IPTG誘導，24 h后終止，離心取沉淀進行SDSPAGE，與對照相比，含重組質粒的重組菌沉淀在26 ku附近出現(xiàn)了蛋白條帶，與預測的大小相符，如圖4。

2.4 枯草芽胞桿菌發(fā)酵液中蛋氨酸含量測定的結果

蛋氨酸標準品衍生液HPLC結果見圖5，根據(jù)標準品各個濃度的峰面積制作標準曲線見圖6，給出回歸方程。Bacillus subtilis的HPLC檢測結果和重組菌的HPLC檢測結果見圖7、圖8。重組菌的蛋氨酸含量是0.47 μg/mL，野生菌的蛋氨酸含量是0.39 μg/mL，結果重組菌蛋氨酸含量比野生菌提高了20.51%(n=5)。

3 討論

本實驗所用的zein是富含蛋氨酸蛋白的基因，從它的氨基酸序列可知蛋氨酸的含量為20%。通過基因工程的方法將其轉入到枯草芽胞桿菌中，從而使枯草芽胞桿菌中蛋氨酸含量提高了20.51%。益生菌中枯草芽胞桿菌現(xiàn)如今作為宿主已經(jīng)成功表達了很多種類的基因［8-16］，但將植物中zein轉入到益生菌枯草芽胞桿菌中還屬首例。本實驗成功地在枯草芽胞桿菌中表達了植物來源的富含蛋氨酸基因，下一步的研究就是要實現(xiàn)更高效的表達。本研究為今后開展該基因在益生菌中高效表達并應用于飼料添加劑方面提供了重要工作基礎。

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