黑曲霉原生質體誘變選育果膠酶高產菌株

陳林，王明茲，柯崇榕，高媛媛，莊秀紅，楊章萍，牛俊巍，黃建忠

(福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心生命科學學院福建省現代發酵技術工程研究中心，福建福州350108)

果膠是一種廣泛存在于植物界中的高分子聚糖化合物，是植物細胞壁的重要組成成分［1］。果膠酶是能分解果膠類物質的復合酶，通常包括原果膠酶(Protopectinase)、果膠酯酶(Pectinesterase)和果膠解聚酶(Depolymerizing enzymes)［2］。果膠酶是人們生活中最早應用的酶類之一，也是當前世界四大酶制劑之一［3］，廣泛應用于果蔬汁的生產和澄清［4］、天然產物提取、紡織品生物脫膠［5］、造紙生物制漿、食品加工以及單細胞產品生產等［6］。果膠酶的工業化生產均采用微生物發酵方法進行，選育果膠酶高產菌株是國內外果膠酶研究熱點。Nakkeeran等［7］篩選到1株碳黑曲霉As-pergillus carbonarius，通過深層固體發酵聚半乳糖醛酸酶酶活力高達7 000 U/mg;杜國軍等［8］通過紫外誘變選育了1株果膠酶活力為2 000 U/g的黑曲霉HY。黑曲霉(A.niger)是國際公認的安全菌株(GRAS)，也是美國(FDA)認可使用安全的產酶微生物之一。黑曲霉產生的果膠酶酶系最全，可直接用于食品工業。黑曲霉EIM6是楊欣偉等［9］篩選獲得的1株果膠酶高產菌株，其果膠酶活力可達46 598.08 U/mL。本文采用UV和NTG原生質體誘變技術，篩選高產果膠酶的黑曲霉突變株，為發酵生產果膠酶提供穩定的生產菌株，具有一定的理論和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株黑曲霉(Aspergillus niger)EIM6，由福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心保藏。1.1.2培養基孢子產生與菌絲生長培養基：PDA培養基［10］;原生質體再生培養基：PDA固體培養基(添加NaCl 0.5 mol/L);發酵產酶培養基(%)：甜菜渣2.8，橘皮粉4.0，KH2PO40.8，(NH4)2SO40.4，CaCO30.6，自然pH;篩選平板(%)：果膠0.2，瓊脂2.0。

1.2 方法

1.2.1 果膠酶活力測定采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)［9］測定果膠酶活力。1個酶活力單位定義為在50℃，pH 3.5的條件下，1 min水解果膠產生1 μg還原糖(以半乳糖醛酸計算)所需的酶量。

1.2.2 黑曲霉EIM6原生質體的制備及再生取-80℃保藏的黑曲霉菌種1管，接種于PDA斜面培養基，28℃活化培養4～6 d。將生長旺盛的斜面孢子轉接于液體PDA培養基，28℃培養20 h，用擦鏡紙過濾收集菌絲。將菌絲置于Φ=6 cm培養皿中，添加1.5%溶壁酶和1.5%纖維素酶于30℃、60 r/min搖床上進行酶解2 h制備原生質體［11］，4 000 r/min離心5 min，高滲穩定劑洗滌重懸獲得106cfu/mL的原生質體懸液。

1.2.3 黑曲霉原生質體UV誘變取5 mL原生質體懸液于Φ=6 cm的培養皿中，置于磁力攪拌器上于15 W紫外燈下30 cm處進行誘變。分別于30、60、90、120、150、180、210、240 s時間點取樣，用雙層平板法再生，計算致死率。

1.2.4 黑曲霉原生質體NTG誘變將原生質體懸液分別用不同濃度NTG誘變處理30 min，濃度分別為0、25、50、100、150、200、250、300、350 μg/mL，誘變后用雙層平板法再生，計算致死率。

1.2.5 高產突變株的初篩和復篩將再生后的單菌落移至初篩平板靜置8 h，剛果紅染色30 min，1 mol/L NaCl溶液浸泡1h，挑取透明圈較大的菌落到斜面培養基上培養純化［9］。挑取初篩菌的成熟孢子至30 mL發酵培養基中進行發酵復篩。接種量為107cfu/mL，發酵條件為28℃，250 r/min，培養80 h后測定發酵液中果膠酶活力。

1.2.6 突變株遺傳穩定性分析將經UV和NTG誘變篩選獲得酶活力最高的2個菌株經8次連續傳代培養，測定其果膠酶活力，分析果膠酶高產突變株的遺傳穩定性。

2 結果與分析

2.1 制備原生質體

黑曲霉菌絲體在酶的作用下，菌絲斷裂形成原生質體。酶解1 h，大部分菌絲斷裂成小段，形成部分原生質體(圖1a所示);酶解2 h，大量原生質體產生(圖1b所示)。因此，選用酶解2 h制備形成的原生質體進行誘變實驗。

圖1 黑曲霉EIM6原生質體釋放過程Fig.1 Protoplast release from Aspergillus niger EIM6

2.2 原生質體UV誘變突變株篩選

紫外照射的時間和致死率成正比，0～50 s內隨著紫外照射時間延長原生質體死亡率迅速上升(圖2)，據報道［12］采用70%～80%致死率的原生質體正突變率較高。本實驗采用25 s的UV(75%致死率)誘變來篩選果膠酶高產突變株。

雙層平板法進行原生質體再生，隨機挑選1 000個再生菌株轉接于初篩平板(圖3)，選取透明圈最大的25個單菌落進行復篩。搖瓶復篩表明，15個突變株的果膠酶活力均有不同程度的提高，其中EIM6-U11酶活力最高，可達69 347.3 U/mL，比出發菌株提高了48.82%(圖4)。

2.3 原生質體NTG誘變突變株篩選

NTG的濃度和致死率成正比，隨著NTG濃度的增加，原生質體的致死率迅速上升(圖5)。本實驗采用濃度為50 μg/mL NTG誘變原生質體來篩選果膠酶高產突變株。

圖5 NTG誘變致死率Fig.5 The lethality rate of protoplasts from Aspergillus niger EIM6 mutagenesis by NTG

NTG誘變篩選方法和紫外誘變篩選方法相同，從再生培養平板的單菌落中，用打瓊脂塊法挑取約1 000株誘變株于初篩平板上，染色洗脫后挑取透明圈較大的15個單菌落，轉接至PDA斜面進行培養，3 d后接種至復篩發酵產酶培養基中進行發酵和測酶活力(圖6)。

圖6 NTG誘變果膠酶高產菌株Fig.6 High pectinase production strain from mutagenesis by NTG

2.4 高產菌株EIM6-U11、EIM6-N5傳代穩定性

為了分析突變株的遺傳穩定性，將其連續傳代8次，然后分別測定其果膠酶活力，結果見表1。表1表明，在95%置信范圍內，高產突變株EIM6-U11和EIM6-N5的酶活力和后代酶活力值相近，差異不顯著(P＞0.05)，可見突變株EIM6-U11和EIM6-N5具有較高的遺傳穩定性。

表1 突變株EIM6-U11和EIM6-N5的遺傳穩定性Table 1 The genetic stability of EIM6-U11 and EIM6-N5

3 結論與討論

原生質體一般是用對數生長期的細胞制備而來，其代謝旺盛、復制頻繁。由于原生質體剝去了細胞壁，對誘變劑敏感性較強，往往正突變率高，并且誘變后易于形成單菌落而便于篩選，所以本實驗對黑曲霉EIM6原生質體進行UV和NTG誘變來選育果膠酶高產突變株。實驗表明黑曲霉EIM6的原生質體對UV和NTG比較敏感，采用原生質體誘變技術選育EIM6果膠酶高產突變株可行。誘變后進行果膠酶高產突變株的篩選，挑取生長較快和菌落直徑較大的單菌落進行透明圈法初篩，并且通過DNS法定量測定發現菌株透明圈大小與酶活力成正比關系，說明此初篩方法穩定且有高通量性。原生質體進行UV和NTG誘變后獲得2株果膠酶活力明顯提高的突變株：EIM6-U11和EIM6-N5，果膠酶活力分別為68 596.57 U/mL和68 879.56 U/mL。本實驗得到的突變株產果膠酶水平在國內選育研究中處于較高水平，并可對其進一步改造提高產酶水平。此外，由于固態發酵產果膠酶于深層液體發酵相比，有酶活力高、發酵成本低的優點，國內果膠酶的工業生產領域中，固體發酵生產方式占主導地位，所以還可以通過對EIM6-U11和EIM6-N5固體發酵條件優化進一步提高果膠酶產量。

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