不同巢材鳥巢中優(yōu)勢(shì)菌群的分離鑒定

朱春玉，徐劍，萬冬梅，李輝，霍雅鵬

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院遼寧省動(dòng)物資源與疫病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽110036)

鳥類的活動(dòng)范圍大，很容易受到一些病原微生物感染并將其大范圍地傳播。鳥類疾病通常由細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲等病原體引起。這些病原微生物對(duì)鳥類自身種群、生境周圍的人和家養(yǎng)動(dòng)物都構(gòu)成潛在的威脅。而且疾病會(huì)對(duì)鳥類的身體、生理、繁殖能力、行為及其他方面造成功能障礙，影響鳥類的健康，從而降低其存活能力［1］。因此研究不同環(huán)境鳥類伴生致病菌為鳥類疾病的監(jiān)測(cè)和防治，野生動(dòng)物、家養(yǎng)動(dòng)物與人共患傳染病的研究，提供一些基本的科學(xué)依據(jù)。鳥巢是鳥類在繁殖期產(chǎn)卵、孵化直至雛鳥離巢而選擇或筑造的一種臨時(shí)性結(jié)構(gòu)，對(duì)鳥類的繁殖具有極其重要的意義，探討鳥類在筑巢選材上的規(guī)律有助于了解鳥類的繁殖生物學(xué)特性。鳥類在對(duì)巢材的選擇上具有多樣性，觀察發(fā)現(xiàn)有很多鳥類選擇蘚類植物作為巢材。例如，Campbell＆Ferguson(1972)報(bào)道了英國(guó)常見鳥類中有53種利用蘚類植物筑巢;Breil＆Moyle(1976)分析了9種鳥的巢，發(fā)現(xiàn)其中的蘚類植物多達(dá)60種。周艷等［2］對(duì)北京地區(qū)4種雀形目鳥類鳥巢中的蘚類植物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)巢材組成中共有7種蘚類植物。杜楊等［3］報(bào)道分布在遼寧地區(qū)的雜色山雀主要以7科8屬的蘚類植物作為巢材。為什么這么多的鳥類尤其是洞巢鳥類選擇蘚類植物作為巢材?本研究擬從不同巢材的鳥巢中優(yōu)勢(shì)菌群的差異角度探索蘚類植物在鳥類繁殖中的意義，此類研究在國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料苔蘚類巢材和對(duì)照巢材草葉巢材各5份，均取自遼寧仙人洞國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)懸掛的鳥類人工巢箱中。

1.1.2 試劑牛肉膏、蛋白胨和瓊脂均購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限公司;蛋白酶K、溶菌酶、DNA Taq聚合酶和2 000 bp ladder Marker均購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 巢材微生物分離菌種分離所用培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨和高氏一號(hào)培養(yǎng)基。將制備好的平板培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中1～2 d后檢查，確認(rèn)沒有污染方可使用。然后采用稀釋法分離培養(yǎng)。即分別稱取巢材5 g，置于盛有90 mL無菌水的150 mL三角瓶中，于200 r/min的振蕩器上振蕩10～15 min，使巢材均勻分散，靜止數(shù)分鐘，在超凈工作臺(tái)上，吸取1 mL懸浮液置于9 mL滅菌水中稀釋得10倍液，依次按10倍法稀釋，稀釋到10-6成一系列稀釋液。試驗(yàn)前取不同濃度梯度、不同取樣量進(jìn)行預(yù)試，每個(gè)處理重復(fù)3次，根據(jù)預(yù)試結(jié)果，確定各巢材樣細(xì)菌、放線菌適宜稀釋梯度和接種量。各種菌接種后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～15 d后檢查結(jié)果，統(tǒng)計(jì)各微生物的數(shù)量。

1.2.2 不同巢材優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與放線菌的分離純化

將1.2.1分離培養(yǎng)的細(xì)菌計(jì)數(shù)后，根據(jù)細(xì)菌菌落的形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)性狀對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步歸類并統(tǒng)計(jì)其數(shù)量，在10-1～10-6濃度梯度平板中均出現(xiàn)菌落數(shù)比率大于25%的菌株，確定為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌［4］。挑取優(yōu)勢(shì)細(xì)菌單菌落進(jìn)行純化保存，并統(tǒng)一編號(hào)為CX1、CX2、CX3...TX1、TX2、TX3...(其中，CX表示草葉巢材中分離出的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌;TX表示從苔蘚巢材中分離得到的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌);將分離純化后的放線菌菌株統(tǒng)一編號(hào)為：TF1、TF2、TF3...CF1、CF2、CF3...(CF表示草葉巢材中分離出的放線菌，TF表示苔蘚巢材中分離出的放線菌)。將所有優(yōu)勢(shì)菌株編號(hào)后進(jìn)行保存，待進(jìn)一步鑒定。

1.2.3 不同巢材優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和放線菌的鑒定①形態(tài)特征及培養(yǎng)特征的測(cè)定：經(jīng)純化的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與放線菌分別劃線接種于牛肉膏蛋白胨和3種放線菌鑒定培養(yǎng)基上，恒溫箱中培養(yǎng)2～5 d后觀察并描述菌落的形態(tài)、大小、光澤、質(zhì)地、邊緣特征、表面特征、隆起形狀、透明度、菌落及培養(yǎng)基的顏色等特征;②生理生化特性的測(cè)定：采用周德慶［5］的方法進(jìn)行生理生化特性分析;③16S rRNA基因序列分析：優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與放線菌的DNA提取采用反復(fù)凍融法，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：P1：5'-CCG GAT CCAGAG TTT GAT CAT GGC TCAGCA-3'，P2：5'-CGG GAT CCTACG GCTACC TTG TTACGACTT-3'。本實(shí)驗(yàn)的PCR引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(總體積29 μL)：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)2 μL，引物1(27f)2.5 μL，引物2(1492r)2.5 μL，TaKaRa Ex Taq(5 U/μL)0.5 μL，模板DNA 3 μL，無菌去離子水16 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃5 min;94℃30 s，57℃30 s，72℃1.5 min;30個(gè)循環(huán);72℃5 min。PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。將所測(cè)得的16S rRNA序列用BLAST搜索工具從Gen-Bank中調(diào)出與其相關(guān)的16S rRNA序列，然后用CLASTAL X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并采用MEGA4.1軟件中的鄰位相接法(N-J法)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建與同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同巢材中優(yōu)勢(shì)菌群的分離結(jié)果

不同巢材樣品的稀釋液，采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，根據(jù)細(xì)菌菌落的形態(tài)學(xué)特征和培養(yǎng)性狀對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步歸類，經(jīng)過多次的分離純化共從10份巢材中分離出6種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，其中苔蘚巢材與草葉巢材中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌各3株，依次為TX3、TX4、TX12、CX3、CX13、CX20。利用高氏一號(hào)培養(yǎng)基共從巢材中分離出8種放線菌，其中草葉巢材3種，苔蘚巢材中5種。將分離出的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和放線菌進(jìn)一步純化，進(jìn)行保存和下一步的鑒定實(shí)驗(yàn)。

2.2 菌體的個(gè)體形態(tài)觀察及生理生化鑒定結(jié)果

2.2.1 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌體的個(gè)體形態(tài)觀察及生理生化鑒定結(jié)果分離出6株優(yōu)勢(shì)菌株中，除TX3菌落為蠟樣不透明、表面粗糙外，TX4、TX12、CX3、CX13和CX20菌落均光滑發(fā)亮，表面呈粘稠狀，其中TX4與CX20為土黃色，CX3與CX13為乳白色，TX12為蟹黃色，所有菌體都呈桿狀。其生理生化特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 不同巢材所獲優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的生理生化特性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The physiological characteristics of dominant bacterial colonies obtained from different nest materials

所有菌株硝酸鹽還原和觸酶反應(yīng)均為陽性，均能產(chǎn)酸。其中只有TX3菌株的乳糖反應(yīng)與氧化酶反應(yīng)為陰性，TX3、TX12、CX13和CX20的MR反應(yīng)與VP反應(yīng)均為陰性，TX3、TX4、CX13和CX20均能產(chǎn)生吲哚，TX4、CX13和CX20革蘭染色呈陰性，其余3株呈陽性。

2.2.2 放線菌的個(gè)體形態(tài)觀察及鑒定結(jié)果經(jīng)過多次的分離純化共得到放線菌TF1、TF2、TF3、TF4、TF6、CF2、CF3、CF4 8株，其培養(yǎng)特征實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 不同巢材所獲放線菌在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征Table 2 Cultivating characteristics of actinomycetes obtained from different nest materials in different media

除TF1外，其余7株放線菌均有氣生菌絲和孢子絲特征性結(jié)構(gòu)，孢子絲或螺旋或波曲，均呈彎曲狀，根據(jù)形態(tài)特征初步將其定為鏈霉菌屬。在淀粉瓊脂培養(yǎng)基上，除TF1產(chǎn)生檸檬黃色色素，其他7株放線菌均不產(chǎn)生色素。根據(jù)鏈霉菌鑒定手冊(cè)，TF1孢子絲灰色，基絲淺黃，應(yīng)歸為金色類群;TF2孢子絲淡紫灰色，基絲乳黃色，將其歸為淡紫灰類群;TF3孢子絲灰色，基絲無色，歸為燼灰類群;TF4孢子絲灰色，基絲深褐色，歸為灰褐類群;TF6孢子絲白色，基絲乳脂色，歸為白孢類群;CF2孢子絲灰色，基絲無色，歸為燼灰類群;CF3孢子絲白色，基絲淺褐色，歸為白孢類群;CF4孢子絲淺灰色，基絲栗棕色，歸為灰褐類群。

2.3 菌體的16S rRNA基因序列分析

2.3.1 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位的確定將所測(cè)得的6個(gè)細(xì)菌菌株的基因序列與GenBank中已有的16S rRNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取同源性高的菌株并結(jié)合伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)描述的生理生化特性對(duì)所測(cè)菌株進(jìn)行鑒定。

TX3菌株為芽胞桿菌屬，與蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)親緣關(guān)系最近，序列相似性為100%，結(jié)合生理生化反應(yīng)可鑒定為TX3菌株為蘇云金芽胞桿菌。TX4菌株為腸桿菌屬，與陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)親緣關(guān)系近，序列相似性為99%。TX12菌株為棒狀桿菌屬，與馬氏棒桿菌(Corynebacterium matruchotii)親緣關(guān)系最近，序列相似性為99%。CX3菌株為腸桿菌屬，與霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei)親緣關(guān)系最近，序列相似性為99%。CX20菌株為假單胞菌屬，與麝香石竹假單胞菌(Pseudomonas caryophylli)親緣關(guān)系最近，序列相似性為99%。CX13菌株為假單胞菌屬，與丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)親緣關(guān)系最近，序列相似性為99%。結(jié)合6株細(xì)菌的菌體特征和生理生化鑒定結(jié)果確定了苔蘚巢材中的3株細(xì)菌分別屬于芽胞桿菌屬、腸桿菌屬和棒狀桿菌屬，草葉巢材中的3株細(xì)菌屬于腸桿菌屬和假單胞菌屬。

2.3.2 放線菌16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位的確定提取放線菌基因組DNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將結(jié)果送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)定的8個(gè)菌株的16S rRNA基因在1 435～1 475個(gè)堿基之間。經(jīng)測(cè)序結(jié)果BLAST分析，8株放線菌都屬鏈霉菌屬，根據(jù)《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》中鏈霉菌屬內(nèi)12類群區(qū)分方法將8株放線菌分別劃分類群。在各菌株所屬類群中選取生理指標(biāo)相似菌種的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列構(gòu)建NJ進(jìn)化樹，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 根據(jù)8株放線菌菌株16S rRNA基因序列構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹Fig.1 NJ phylogenetic tree constructed by 16S rRNA gene sequences of 8 strains’actinomycetes strains

結(jié)合8株放線菌菌株16S rRNA構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹及其培養(yǎng)特征以及生理生化特征可確定，不同巢材中分離出來的8株放線菌均為鏈霉菌屬。TF1菌株與金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)親緣關(guān)系最近，序列相似性為99%，結(jié)合生理生化及培養(yǎng)特征確定TF1菌株為金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)。TF2菌株與紅色淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces rubrolavendulae)序列相似性為100%，結(jié)合培養(yǎng)特征可以確定二者為同一種菌，屬淡紫灰類群。TF3菌株與銀樣鏈霉菌(Streptomyces argenteolus)序列相似性為99%，其培養(yǎng)特征與Streptomyces argenteolus相似，但Streptomyces argenteolus不利用蔗糖，棉子糖，因此還需對(duì)TF3進(jìn)行進(jìn)一步的分類鑒定。TF4菌株與魯特格斯鏈霉菌(Streptomyces rutgersensis)序列相似性為98%，根據(jù)鏈霉菌鑒定手冊(cè)將其歸為灰褐類群，Streptomyces rutgersensis在馬鈴薯塊上產(chǎn)生淺褐色素，TF4在馬鈴薯塊上無色素，因此二者是否為同一種菌，還需進(jìn)一步鑒定。TF6菌株與膠樣鏈霉菌(Streptomyces gelaticus)序列相似性為99%，根據(jù)鏈霉菌鑒定手冊(cè)將其歸為白孢類群，與Streptomyces gelaticus的特征基本相似，Streptomyces gelaticus在馬鈴薯塊上基絲微綠變黑，有帶微黃邊緣的色素，因此二者有可能是同一種菌。CF2菌株與灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)序列相似性為100%，結(jié)合生理生化特性基本可以確定二者為同一種菌，屬燼灰類群。CF3菌株與純白鏈霉菌(Streptomyces candidus)序列相似性為99%，根據(jù)培養(yǎng)特征依據(jù)鏈霉菌鑒定手冊(cè)將其歸為白孢類群，與Streptomyces candidus相比，其生理生化特征相似，但Streptomyces candidus在馬鈴薯塊上基絲無色，呈地衣狀，無色素或產(chǎn)生微褐色素，因此二者是否為同一種菌，還需進(jìn)一步鑒定。CF4菌株與小孢鏈霉菌(Streptomyces microsporus)序列相似性為99%，根據(jù)鏈霉菌鑒定手冊(cè)將其歸為灰褐類群，但Streptomyces microsporus在葡萄糖天門冬素瓊脂上不產(chǎn)生色素，在馬鈴薯塊上基絲呈褐黃、薯塊栗色，與CF4有差別，因此二者是否為同一種菌還需要進(jìn)一步的分類鑒定。

3 討論

苔蘚植物是一類以孢子繁殖，由水生向陸生過渡的高等植物，其分布廣泛，多數(shù)能夠合成具有抗微生物活性的次生代謝產(chǎn)物以保護(hù)自身，抵抗微生物的侵害。Pinheiro［6］研究報(bào)導(dǎo)了25種苔蘚植物不同溶劑對(duì)枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌3種細(xì)菌的抗菌活性。衣艷君［7］對(duì)黃牛毛蘚(Herba ditrichi)及毛尖紫萼蘚(Grimmiapilifera beauv)的水浸液進(jìn)行了抑菌圈試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這兩種植物的水浸液對(duì)幾種細(xì)菌和真菌均有不同的抑制活性。Gang等［8］對(duì)9種苔蘚植物的水提液和醇提液的抑菌活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明這幾種苔蘚植物的醇提液對(duì)4種常見的細(xì)菌有較明顯的活性，而水提液的效果不明顯。Meenakshi等［9］分析15種印度苔蘚乙醇萃取物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)暖地泥炭蘚(Sphagnum junghuhnianum)、爪哇扭口蘚(Barbula javanica)等7種蘚類對(duì)8種真菌具有抗菌活性。本研究對(duì)苔蘚巢和草葉巢中的放線菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，從苔蘚巢材中分離出5種優(yōu)勢(shì)放線菌，從草葉巢材中分離出3種優(yōu)勢(shì)放線菌。從苔蘚巢材中分離出的放線菌中有一種優(yōu)勢(shì)放線菌為金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)，以往的研究表明金色鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物—金核霉素作為殺菌劑對(duì)多種細(xì)菌病害具有優(yōu)異效果并對(duì)人畜與環(huán)境具有良好安全性［10］。從苔蘚巢材中分離出另外4種放線菌也均為鏈霉菌，其中灰色鏈霉菌同時(shí)存在于草葉巢中。苔蘚中鏈霉菌無論在數(shù)量和種類上都多于草葉中的鏈霉菌(表2)，而鏈霉菌的生防作用一直被人們所研究和利用［11］，這可能是一些鳥類在繁殖期選取苔蘚作為巢材的原因之一。

本研究在草葉巢材中分離的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌中，3株都為革蘭陰性短桿菌(假單胞菌屬和腸桿菌屬)，在苔蘚中分離得到的3株優(yōu)勢(shì)菌中2株為革蘭陽性長(zhǎng)桿菌(芽胞桿菌屬和棒狀桿菌屬)，1株為2種材料中共有的革蘭陰性菌(腸桿菌屬)。其中蘇云金芽胞桿菌已被作為生物殺蟲劑運(yùn)用在農(nóng)業(yè)方面［12］，而CX13、CX20所屬的假單胞菌的致病性也越來越多地被研究者發(fā)現(xiàn)［13-14］。苔蘚中放線菌數(shù)量多于草葉中放線菌也從另一個(gè)角度解釋了苔蘚中細(xì)菌數(shù)少于草葉中細(xì)菌數(shù)的可能的原因，綜合以上研究結(jié)果可以看出，苔蘚與草葉相比是一種更安全的巢材，能夠?yàn)殡r鳥提供更有利生長(zhǎng)的生存環(huán)境，這或許也是一些鳥類選擇苔蘚作為巢材的原因之一。

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