1株聚乳酸降解細菌的篩選、鑒定及產酶研究

劉玲緋，李凡，林秀梅，劉東波，夏紅梅，陳珊

(東北師范大學生命科學學院，吉林長春130024)

塑料以其質優、價廉、強度高等特性，自19世紀以來在工農業生產和社會生活中得到廣泛的應用。在塑料給人們帶來方便的同時，也因其在自然環境中難以分解而產生了大量的“白色垃圾”，嚴重地破壞了生態平衡、危害動植物生長、威脅人類健康［1］，因此生物可降解塑料的開發和應用受到了人們的重視。聚乳酸(poly-L-lactic acid，PLA)是一種新興的生物可降解材料，是以谷物發酵而得到的乳酸為單體，通過化學合成方法聚合而成的脂肪族高分子聚合物。除了可生物降解性以外，PLA還具有較好的機械性能、熱塑性、生物相容性及產物安全性，成膜后高透明度，纖維的高拉伸強度和易于加工的特性等，因此PLA被認為是最具潛力的替代現有塑料的新型“生態材料”之一，備受世界各國的關注［2］。隨著研究的不斷深入，人們發現雖然PLA在許多物理化學和機械性能上要優于聚羥基丁酸酯(PHB)、聚己內酯(PCL)等材料，但其在自然界中的生物降解速率要比PHB和PCL緩慢得多，環境中降解PLA的微生物數量不到0.04%，遠遠低于PHB、PCL等材料的降解微生物數量(0.8%～11%)［3-4］。目前，人們已經分離了大約幾十種能夠降解PLA的菌株，其中大部分屬于特殊的放線菌類［5］，只發現了少量的對PLA具有降解作用的細菌和真菌［6-7］，PLA降解微生物和酶類都具有一定的特殊性。本實驗主要篩選了1株對PLA具有降解作用的細菌，并對其進行了鑒定和誘變，對其產酶條件進行了初步的研究，旨在獲得高效的降解菌株和最佳的產酶條件，為PLA降解微生物和降解酶特殊性的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 PLA材料PLA顆粒及PLA薄膜由中國科學院長春應用化學研究所提供，熔點164.6℃，相對分子質量為2.074×105。

1.1.2 培養基①PLA培養基：PLA 1 000 mg，1 mol/L K2HPO49.4 mL，1 mol/L KH2PO40.62 mL，(NH4)2SO41 000 mg，NaCl 100 mg，MgSO4·7H2O 200 mg，Na2WO40.5 mg，MnSO40.5 mg，CaCl2·2H2O 20 mg，FeSO4·7H2O 10 mg，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg，蒸餾水定溶至1 L;②蛋白酶活力篩選培養基：酪蛋白10 g，牛肉膏3 g，Na2HPO42 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，0.4%溴麝香草酚藍溶液12.5 mL，pH 7.4;③PLA乳化液的制備：10 mL三氯甲烷溶解0.4 g PLA顆粒，待充分溶解后，加入0.04 g Plysurf A210G乳化劑和100 mL pH 8.0的磷酸鹽緩沖液，搖勻后置于超聲波細胞破碎儀中乳化，功率300 W，工作時間6 s，共90次。乳化結束后將乳化液置于磁力攪拌器上75℃加熱攪拌90 min，使溶于其中的三氯甲烷完全揮發，再用pH 8.0的磷酸鹽緩沖液定容至400 mL備用。

1.2 方法

1.2.1 PLA降解菌的分離純化將10 g從不同環境中采集到的污泥置于以PLA為唯一碳源的100 mL的液體培養基中，37℃振蕩進行富集培養，采用平板稀釋涂布法在PLA唯一碳源平板上對降解菌株進行分離純化。

1.2.2 PLA降解情況的測定分別以PLA粉末和PLA乳化液作為唯一碳源，接入6 mL經37℃，130 r/min振蕩培養24 h的種子液，于37℃，130 r/min條件下培養。觀察培養過程中培養液的變化。在進行薄膜降解實驗時，將PLA膜(1.0 cm×1.0 cm，0.01～0.02 g)置于100 mL的PLA培養基中(PLA粉末由薄膜代替)，接入6 mL經37℃，130 r/min振蕩培養24 h的菌液，于37℃，130 r/min條件下培養。每隔3 d取膜1次并稱重，計算薄膜的失重率。對降解后的PLA薄膜和未接入菌體的PLA對照薄膜進行掃描電子顯微鏡觀察。

1.2.3 菌種鑒定形態學及生理生化特征測定：參照《常見細菌系統鑒定手冊》［8］;16S rDNA序列測定及系統發育分析：使用BioFlux的基因組DNA提取試劑盒提取純化菌株的基因組DNA作為模板，用通用引物27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')和1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')擴增該菌株的16S rDNA。PCR產物進行電泳和凝膠回收后送上海生工測序。測序結果在NCBI數據庫中進行Blast比對，并用MEGA 3.1軟件進行系統進化樹分析。

1.2.4 紫外線誘變及突變菌株的篩選［9］在無菌的平皿中倒入5 mL處于對數期的DSL09菌液，置于磁力攪拌器上攪拌，在垂直距離為30 cm的15 W紫外燈(波長為254 nm)下分別照射0、30、60、90、120、150 s。將照射后的菌液分別稀釋至106～108個/mL，并涂布在蛋白酶活力篩選培養基中，在黑暗條件下37℃恒溫培養2 d，觀測菌落及水解透明圈的大小，計算HC值(HC值=透明圈直徑/菌落直徑)，根據HC值進行初篩。將平板初篩得到的菌種進行活化，分別接種于PLA唯一碳源培養基中，于37℃恒溫振蕩培養，測定其產酶高峰，以未誘變的菌株作對照，篩選出具有較強PLA降解活力的突變菌株。

1.2.5 PLA降解酶活力測定方法［10］取0.4 g/mL的PLA乳化液1 mL與等體積的粗酶液在60℃恒溫水浴鍋中保溫24 h，利用乳酸試劑盒測定上清液中乳酸的量，通過計算酶反應中乳酸的生成量來表征PLA降解酶活力。同時對滅活的酶液進行同樣的操作，作為酶活測定的對照。

1.2.6 蛋白酶活性測定方法［10］以pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，質量分數為1%的酪蛋白溶液作為底物，加入1 mL稀釋好的酶液，混合后在37℃水浴鍋里反應10 min;再用質量分數為10%的三氯乙酸終止反應，靜置30 min后10 000 r/min離心10 min，在280 nm條件下測定上清液的吸光值。以滅活酶液的反應體系作為空白對照。

1.2.7 發酵條件的優化對上述篩選到的產PLA降解酶活力最高的菌株在誘導物種類及含量、初始pH值、接種量、發酵溫度、發酵時間上進行優化，獲得最適的產酶條件。以測定的最適產酶條件為參數，對菌株進行發酵，測定發酵液的PLA降解酶活力和蛋白酶活力，繪制產酶曲線。酶活測定方法參照1.2.5和1.2.6。

2 結果與分析

2.1 PLA降解菌的篩選及降解性能測定

將污泥接入以PLA粉末為唯一碳源的液體培養基中進行搖瓶富集，富集液采用平板菌落法在PLA唯一碳源平板上進行分離純化，結果從污泥中篩選出1株具有PLA降解活力的細菌，編號為DSL09。該菌株對PLA粉末、PLA乳化液及PLA薄膜都具有較好的降解作用，以PLA粉末和乳化液為碳源時，菌株生長旺盛;以PLA薄膜為碳源時，薄膜重量隨著培養時間的延長而下降，經過40 d左右的培養后，薄膜發生崩解破碎，失重率為10%，而未接入菌體的對照薄膜，雖然同樣在液體培養基中振蕩，并且也因為一定的水解作用而發泡變白，但并未發生崩解，說明菌株DSL09對PLA材料具有明顯的降解作用。同時薄膜的掃描電子顯微鏡觀察結果也顯示出，經過菌體作用的薄膜表面出現了大量的孔洞，而未經菌體作用的對照表面仍然光滑，因此進一步判定了DSL09的PLA降解作用。

圖1 PLA薄膜降解的形態圖片Fig.1 Degradation of PLA film by strain DSL09

2.2 PLA降解菌的鑒定

圖2 DSL09的菌體形態Fig.2 The morphology of strain DSL09

采用形態學觀察、分子生物學分析及生理生化特征測定等方法對DSL09菌株進行鑒定。觀察結果顯示DSL09菌落呈圓形、不透明、白色、表面光滑的隆起狀;顯微鏡下可見菌體為短桿菌，有芽胞，革蘭染色為陽性(圖2)。

通過對菌株16S rDNA的擴增和測定，獲得1條1 512 bp的核苷酸序列，在NCBI數據庫中進行Blast比對，發現該序列與Bacillus sp.MK03、Bacillus sp.XJSL4-5等芽胞桿菌的16S rDNA具有99%的相似性，根據比對結果構建了DSL09與其他相關菌株的系統發育樹，結果見圖3，也顯示出該菌株在系統發育樹上與芽胞桿菌位置較近。

圖3 根據16S rDNA序列構建的DSL09菌株的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of DSL09 based on 16S rDNA sequences

為對該菌株進行進一步確定，參照《常見細菌系統鑒定手冊》中芽胞桿菌屬的種間鑒別特征對菌株的生理生化特性進行了測定，結果(表1)顯示DSL09菌株在理化性質上接近地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)，但不同的是該菌株在55℃條件下不能生長，因此該菌株可能屬于芽胞桿菌屬新的種或亞種。

表1 菌株DSL09生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical properties of strain DSL09

2.3 紫外線誘變及突變菌株的篩選

為提高DSL09菌株的PLA降解酶活力，對其進行紫外線誘變處理，而紫外誘變的前提是具有相對高通量的篩選方法，根據文獻報道和本實驗室的研究結果，以PLA做底物，菌株生長時不易形成明顯的透明圈，因此用PLA平板篩選突變株較難。但目前發現的大多數PLA降解酶都屬于蛋白酶類，可以嘗試應用靈敏度高、重現性好的蛋白酶篩選培養基來對誘變后的菌株活力進行初篩，再結合PLA唯一碳源液體培養法進行復篩，最終獲得PLA降解酶活力升高的菌株。

通過觀察并測定菌株在蛋白酶篩選平板上形成的水解透明圈及菌落大小，發現最終經30 s和60 s誘變后的菌株具有較大的HC值，挑選其中的4株菌分別接入以PLA為唯一碳源的液體培養基中，置于37℃，130 r/min振蕩培養進行復篩。結果顯示4株菌的PLA降解酶活力均明顯高于原始菌株DSL09。其中DSL09-60b的PLA降解酶活力最高，可達到原始菌株酶活力的1.5倍。將其經斜面傳代6次后，測定其PLA降解酶活力，未見明顯變化，說明該菌株具有較穩定的遺傳性能，因此選擇DSL09-60b作為下一步研究的對象。

2.4 最適產酶條件的優化

2.4.1 最適誘導物及其含量的測定根據文獻報道，目前所發現的PLA降解酶基本都屬于蛋白酶類［2］，本實驗在對菌株進行誘變時，即根據這一點采用了蛋白酶活力篩選培養基進行初篩，極大地方便了突變菌株的選出，誘變結果顯示蛋白酶活力提高的突變株其PLA降解酶活力也相應提高，這一結果證明了對于DSL09-60b菌株，其PLA降解酶確實與蛋白酶存在著一定的相關性。因為PLA是人工合成的非天然化合物，如果其屬于蛋白酶類，那么在培養基中添加一定的蛋白酶誘導物，可能對PLA降解酶的產生具有促進作用。本實驗選擇明膠、蛋白胨、酵母膏和酪蛋白為誘導物，分別添加入PLA粉末培養基中，置于37℃恒溫振蕩搖床培養3 d，測定發酵液的PLA降解酶活性，結果見圖4。由圖4可知蛋白類誘導物可以有效地促進DSL09-60b PLA降解酶的產生，用酪蛋白作為誘導物時，菌株產PLA降解酶活性最高。

圖4 不同誘導物對產酶的影響Fig.4 Effect of different inducers on enzyme formation

選擇酪蛋白為誘導物后，分別采用含有0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%的酪蛋白培養基培養菌株3 d。測得當酪蛋白含量為0.5%時，PLA降解酶活力最高(圖5)，說明0.5%是酪蛋白誘導物的最佳添加量。

圖5 誘導物的量對產酶的影響Fig.5 Effect of quantity of inducers on enzyme formation

2.4.2 最佳產酶pH條件的測定將保存于斜面培養基的菌種接種于100 mL含有0.5%酪蛋白的PLA培基中，37℃130 r/min振蕩培養24 h，制備種子培養液。將種子培養液按6%(體積比)接種量接種于100 mL含有0.5%酪蛋白的不同pH(6～9)的PLA培養基中，37℃130 r/min振蕩培養3 d。培養結束后，將發酵液14 000 r/min離心15 min，取上清液測定PLA降解酶活力。

如圖6所示，培養基的初始pH對菌株產酶活力有較大的影響。當培養液為酸性時，PLA降解酶的活力明顯較低，隨著pH升高降解酶活力也隨之升高，當pH為8.0時，PLA降解酶活力達到最高，之后酶活力隨著培養基pH的升高而降低，因此菌株的最佳產酶初始pH為8.0。

圖6 不同pH值對產酶的影響Fig.6 Effect of initial pH on enzyme formation

2.4.3 最適產酶接種量測定將活化24 h的菌種按2%、4%、6%、8%、10%(體積比)的接種量接種于100 mL含0.5%酪蛋白的PLA培養基(pH 8.0)中，在37℃條件下恒溫振蕩培養3 d。培養結束后，將發酵液離心，取上清液測定PLA降解酶活力，結果如圖7所示。當接種量為6%時菌株產PLA降解酶活力最高，而過高或過低的接種量都會影響菌株的產酶效率。

圖7 不同接種量對產酶的影響Fig.7 Effect of quantity of inoculation on eniyme formation

2.4.4 最佳產酶溫度的測定將種子培養液按6%(體積比)接種量接種于100 mL含有0.5%酪蛋白的PLA乳化培養基中，分別在22、27、32、37、42℃5個溫度條件下，130 r/min振蕩培養3 d。培養結束后，取發酵上清液測定PLA降解酶活力，結果如圖8所示。當培養溫度為37℃時，菌株產PLA降解酶的活力達到最高值，而在較高或較低溫度培養菌株時，菌體增殖緩慢產PLA降解酶活力均有所降低。因此，菌株的最適產酶溫度為37℃。

圖8 不同發酵溫度對產酶的影響Fig.8 Effect of temperature on enzyme formation

2.4.5 最佳產酶時間的測定為獲取菌株的最高產酶活力，將種子培養液按6%(體積比)接種量接種于100 mL含有0.5%酪蛋白的PLA培養基中，在37℃，130 r/min條件下振蕩培養，每隔6 h取樣1次，測定發酵液上清的PLA降解活力，結果見圖9。

圖9 不同發酵時間對產酶的影響Fig.9 Effect of time on enzyme formation

由圖9可知，培養時間對菌株產酶能力有較大的影響。在培養至54 h時產PLA降解酶活力最強，此后隨著培養時間的延長其產酶活力呈現下降趨勢，也說明上述培養條件下，54 h為DSL09-60b菌株PLA降解酶的最佳收獲時間。在對最佳培養條件下的產酶曲線進行測定的同時，也測定了該條件下菌株蛋白酶的分泌情況，結果顯示當菌株培養至42 h時產蛋白酶活力最強，與PLA的產酶高峰并不重合，該結果暗示了菌株所分泌的PLA降解酶與蛋白酶之間雖然存在著相關性，但并不具有同一性。

3 討論

從污泥中篩選出1株對PLA具有降解活力的細菌DSL09，經形態學、16S rDNA及生理生化鑒定，認為該菌株為Bacillus sp.。通過紫外誘變，獲得了1株具有較高PLA降解活力的菌株，編號為DSL09-60b。測定該突變菌株的最適產酶條件為0.5%的酪蛋白誘導、初始pH 8.0、接種量6%、37℃培養54 h。

根據文獻報道，目前所發現的PLA降解菌大都屬于放線菌類，而分離的細菌和真菌較少，本文所篩選的Bacillus sp.對于PLA降解機制的闡明具有重要意義。

本文還根據PLA降解酶屬于蛋白酶類的部分報道，嘗試了應用蛋白酶活力篩選培養基對PLA降解酶活力升高的突變株進行初篩的方法，有效地提高了誘變后PLA降解菌株的篩選效率，也證明了對于Bacillus DSL09-60b，其PLA降解酶與蛋白酶確實存在一定的相關性;但同時本實驗也對DSL09-60b菌株產PLA降解酶與蛋白酶的曲線進行了測定，結果顯示培養至42 h時發酵液蛋白酶活力最高，而PLA降解酶活力的高峰則出現在54 h，這一結果說明菌株所分泌的PLA降解酶與蛋白酶并不具有同一性，推測DSL09-60b菌株所分泌的PLA降解酶是包含于菌株分泌蛋白酶內的1種或幾種特殊的蛋白酶類。下一步的工作主要集中于降解酶的分離純化及特性分析，進而闡明PLA的降解機制及降解酶的特殊性。

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