復合菌系RSS-4腐解稻稈過程中的菌系動態(tài)變化

沈德龍，劉甲鋒，李力，陳慧君，關大偉，姜昕，李俊

(中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所，北京100081)

秸稈腐熟菌劑是有機物料腐熟劑中的一個重要品種，它指采用現(xiàn)代化學和生物技術，經(jīng)過特殊的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的、能夠加速農作物秸稈腐熟、分解的活體微生物制劑。近年的研究和實踐證明，應用具有快速降解秸稈物料的腐解菌劑，是解決秸稈還田問題的關鍵。目前，研制開發(fā)理想的作物秸稈快速腐熟劑已成為微生物制劑研發(fā)的一個熱點。同時發(fā)現(xiàn)，研究腐解過程中微生物區(qū)系的演替對于深入了解腐解的機理、優(yōu)化復合菌系生產(chǎn)工藝具有重要意義。采用傳統(tǒng)平板分離方法只能對復合菌系中的可培養(yǎng)微生物組成進行研究，而復合菌系中還含有不可培養(yǎng)的微生物，分子生物學技術的出現(xiàn)使之研究變?yōu)榭赡埽琍CR-DGGE適于準確分析腐解過程中微生物區(qū)系的動態(tài)變化［1-2］。1993年，在Muyzer等［3］首次將該技術應用于微生物生態(tài)的研究后，其迅速被應用于環(huán)境微生態(tài)方面的研究。徐大勇等［4］采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和PCR-DGGE技術研究了人工接種堆肥和自然堆肥微生物群落的演變過程;李國媛等［5］采用分子生物學方法和傳統(tǒng)平板分離方法對秸稈腐熟菌劑細菌菌群及在腐熟過程中的變化進行分析;而王小芬等［6］也以苜蓿為原材料，研究了乳酸菌復合系A12在苜蓿青貯過程中微生物區(qū)系動態(tài)變化。本課題組曾分離篩選了具有降解水稻秸稈能力的復合菌系RSS-4［7］，并對其在傳代過程中的腐解特性進行了研究［8］。本文采用平板計數(shù)法和PCR-DGGE技術對腐解過程中微生物區(qū)系的演變進行了研究，旨在明確稻稈腐解過程中微生物菌群的組成與變化，為秸稈腐解菌劑的菌系篩選優(yōu)化與菌劑生產(chǎn)及應用提供分子微生態(tài)學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種為本實驗室自行篩選構建的稻稈腐解復合菌系RSS-4。

1.1.2 培養(yǎng)條件固體發(fā)酵培養(yǎng)基：稻稈粉(粉碎后過60目篩)75 g，麩皮(粉碎后過60目篩)30 g，營養(yǎng)鹽溶液100 mL，水50 mL，攪拌均勻，自然pH，不對其進行滅菌，接菌后22℃靜置培養(yǎng)。

1.1.3 腐解過程中微生物數(shù)量的變化菌落平板計數(shù)按照中華人民共和國國家標準GB20287-2006的規(guī)定執(zhí)行。

1.2 方法

1.2.1 腐解過程中細菌的DGGE分析①基因組DNA的提?。涸诟膺^程的第2、4、6、8、10、12、14、16、18天分別取樣，采用Bead-beater法提取基因組DNA，其操作步驟見文獻［9］;②細菌基因組16S rDNA V3可變區(qū)的擴增：16S rDNA V3區(qū)PCR擴增見文獻［10］。擴增引物分別為P2：5'-attaccgcggctgctgg-3';P3：5'-cgcccgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggcctacgggaggcagcag-3'。25 mL的PCR擴增體系：10×buffer(不含Mg2+)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，氯化鎂(25 mmol/L)2 μL，引物(10 pmol/μL)1 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.15 μL，稀釋模板1 μL，dd H2O補足至25 μL。PCR反應條件：94℃，4 min;94℃，1 min;65→56℃，1 min;72℃，1 min(每個溫度2個循環(huán));94℃，1 min;55℃，1 min;72℃，1 min(10個循環(huán));72℃，6 min。擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測;③Reconditioning PCR及產(chǎn)物純化：取16S rDNA V3區(qū)PCR擴增產(chǎn)物的十分之一作模版，以與16S rDNA V3區(qū)PCR擴增相同的反應體系和條件，再次進行PCR擴增，但是把循環(huán)數(shù)減少到3;④16S rDNA V3可變區(qū)的多態(tài)性DGGE分析：制作變性劑尿素和甲酰胺梯度膠，用梯度生成儀灌膠。膠板大小為16 cm×16 cm，聚丙烯酰胺的濃度為8%，變性劑的濃度范圍為30%～60%(100%變性劑濃度為7 mol/L尿素，40%甲酰胺)。樣品上樣量為30 μL，電壓75 V，電泳16 h后，EB染色20 min，用GEL DOC EQ凝膠成像系統(tǒng)成像。對于典型的條帶，從膠中切出，再經(jīng)PCR擴增后供堿基序列測定。

1.2.2 腐解過程中真菌的DGGE分析①18S rDNA區(qū)PCR擴增：基因組DNA的提取見1.2.1①。18S rDNA區(qū)PCR擴增見文獻［11］。擴增引物分別為R1616：5'-gcggtgtgtacaaagggcaggg-3';F1427：GC5'-cgcccgccgcgccccgcgcccggccgccgcccccgcccct-ctgtgatgcccttagatgttctggg-3'。25 μL的PCR擴增體系見1.2.1②。PCR反應條件：94℃，5 min;94℃，0.5 min;52℃，1 min;68℃，1.5 min，25個循環(huán);68℃，10 min。擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測;②18S rDNA區(qū)的多態(tài)性DGGE分析：具體的操作步驟見1.2.1④。

2 結果與分析

2.1 腐解過程中微生物數(shù)量的動態(tài)變化

用平板計數(shù)法測定復合菌系RSS-4在對稻稈分解過程中細菌和真菌的數(shù)量動態(tài)變化，結果見圖1和圖2。由圖1可知，在腐解的0～4 d內細菌借助易分解利用的可溶性糖和淀粉等物質急劇增加，細菌數(shù)量最高達到10.0×1011cfu/g，此后隨著易利用物質的減少，細菌的數(shù)量發(fā)生區(qū)系更替，真正起腐解作用的細菌開始起作用，其整體數(shù)量雖然有所下降，但基本保持在4.0×1011cfu/g以上，這一階段正是木質纖維素被快速腐解的時期。8 d后隨著底物的利用越來越難加之產(chǎn)物反饋抑制，細菌的數(shù)量略有下降，但基本穩(wěn)定在2.0×1011cfu/g以上。

圖1 稻稈腐解過程中細菌生長曲線Fig.1 Growth curve of bacteria during the straw's decomposition

圖2 稻稈腐解過程中真菌生長曲線Fig.2 Growth curve of fungi during the straw's decomposition

由圖2可知，在腐解過程中真菌的含量與細菌相比要少得多，其生長曲線也與細菌有所不同，在腐解初期即呈下降趨勢，它在腐解的8～10 d內含量最低，在腐解的第12天有小幅上升，然后趨于穩(wěn)定。由圖2可見，在整個腐解過程中真菌的數(shù)量變化不是很劇烈，這說明真菌可能在腐解全程都在發(fā)揮作用。

2.2 腐解過程中細菌的DGGE分析結果

2.2.1 樣品總DNA提取結果本實驗采用珠式細胞破碎器(Bead-beader)的方法提取復合菌系RSS-4基因組DNA。采用該法提取的基因組DNA片段主要集中在3.0～10.0 kb之間，雖然有少量的彌散帶存在，但是最長DNA可達10.0 kb以上，能夠滿足實驗需要;且由于此方法主要依靠物理方法破壁，受微生物種類差異的影響較小，故樣品中DNA的提取較為全面。此方法簡潔高效，適用于大批量DNA的提取。

2.2.2 PCR擴增結果將樣品的DNA進行COMMUNITY PCR擴增，得到了與預期大小相符的擴增片斷，片段大小約為250 bp，瓊脂糖電泳檢測結果見圖3。Reconditioning PCR結果見圖4。

2.2.3 16SrDNA-DGGE結果復合菌系在腐解不同時期的16S rDNA V3區(qū)-DGGE見圖5。由圖5可知，在稻稈腐解過程中，不同腐解時期細菌的組成呈現(xiàn)出多樣性，變化差異也較為明顯。條帶1、4、7、8、9和10在整個腐解過程內一直存在，為優(yōu)勢菌，而其中又以1、9和10條帶更亮，說明其含量應該更高，為主要優(yōu)勢菌種;條帶3在腐解初期沒有出現(xiàn)，到第4天開始出現(xiàn)并一直維持到腐解結束;類似的還有條帶11和13;而條帶12只在腐解的初期出現(xiàn)，之后迅速消失;條帶6除在第6～8天不明顯外，其余時期均存在;而條帶2卻是交叉出現(xiàn)的，其含量變化不定。將以上條帶割膠回收，克隆并測序，在GeneBank中比對后得出結果見表1。比對結果顯示最高同源性的菌株大部分為不可培養(yǎng)的細菌。

圖5 復合菌系RSS-4在不同腐解時期的16S rDNA PCR-DGGE圖Fig.5 16SrDNA PCR-DGGE profile of fungus components of CMS during the straw's decomposition

表1 復合菌系的細菌變性梯度膠電泳圖中各條帶的近緣菌株Table 1 Identities of DGGE bands of microbial community

其中，純培養(yǎng)所得的Pseudomonas sp.對應DGGE圖譜中的條帶1;其中優(yōu)勢菌株條帶1(Pseudomonas stutzeri)、條帶8(Bacillus sp.)和非優(yōu)勢菌株條帶5(Alcaligenes sp.)均已證實具有降解秸稈的功能。如余金勇等［12］通過剛果紅法初步證明從白蟻腸分離的菌株(Bacillus sp.)能產(chǎn)生纖維素酶，表明其具有分解纖維素的能力。

2.3 腐解過程中真菌的DGGE分析結果

2.3.1 PCR擴增結果將樣品的DNA進行COMMUNITY PCR擴增，得到了與預期大小相符的擴增片斷，片段的大小約為260 bp，瓊脂糖電泳檢測結果見圖6。

圖6 18SrDNA區(qū)片段PCR擴增的電泳圖Fig.6 Agarose gel electrophoresis of 18S rDNA region segment amplified by PCR

2.3.218 S rDNA-DGGE DGGE結果復合菌系在腐解不同時期的18S rDNA DGGE見圖7。

圖7 復合菌系RSS-4在不同腐解時期的18S rDNA PCR-DGGE圖Fig.718 S rDNA-DGGE profile of fungus components of CMS during the straw's decomposition

由圖7可知，復合菌系在腐解不同時期的18S rDNA DGGE如圖中3～9所示，在稻稈腐解過程中，不同腐解時期真菌的組成呈現(xiàn)出多樣性，變化差異較為明顯。其中，條帶6、7、8、9、12、13、16和18在整個腐解過程內一直存在，為優(yōu)勢菌，而其中又以8、9和13條帶更亮，說明其含量應該更高，為主要的優(yōu)勢菌種;條帶10和11在腐解的初期沒有出現(xiàn)，到第4天開始出現(xiàn)并一直維持到腐解結束;條帶3直到第6天才開始出現(xiàn)，但是直到腐解結束一直存在;類似的還有條帶17，它僅在腐解的第14天才開始出現(xiàn);條帶16除了第4天不明顯外，其余時間均出現(xiàn);而條帶1、2、4、5、14和15均在腐解的不同時期偶爾出現(xiàn)一段時間后迅速消失。將以上條帶割膠回收，克隆并測序，在GeneBank中比對后得出結果見表2。

表2 復合菌系的真菌變性梯度膠電泳圖中各條帶的近緣菌株Table 2 Identities of DGGE bands of microbial community

由表2可知，復合菌系RSS-4中的克隆子與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知真菌的18S rDNA序列相似性最高的為100%，最低的為96%;其中可培養(yǎng)的真菌條帶數(shù)共有11個，占庫容總量的61.1%。這表明文庫中大部分真菌為可培養(yǎng)真菌。其中，純培養(yǎng)所得的Graphium penicillioides、Mucor circinelloides分別對應DGGE圖譜條帶中的13和10。根據(jù)已有報道，主要條帶中有纖維素分解功能的菌株有條帶10(Mucor circinelloides)和木質素分解功能的條帶13(Graphium penicillioides)，如王嵐等［13］通過實驗發(fā)現(xiàn)擬青霉所產(chǎn)的木聚糖酶和木糖苷酶協(xié)同作用可將樺木木聚糖完全降解成木糖;而有些至今還未發(fā)現(xiàn)其具有腐解秸稈的能力，但是它們的存在很可能會幫助消除腐解產(chǎn)物，起到協(xié)同作用，從而共同促進了稻稈的腐解。

3 結論

本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和PCR-DGGE技術研究了水稻秸稈腐解復合菌系RSS-4在腐解過程中菌種區(qū)系變化情況。

傳統(tǒng)培養(yǎng)方法顯示，在稻稈腐解過程中，微生物的數(shù)量均呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢，在整個腐解過程中細菌的數(shù)量占優(yōu)勢，真菌的數(shù)量動態(tài)變化不明顯。其中，細菌數(shù)量在腐解第4天高達10.0×1011cfu/g，在稻稈腐解第8天依然保持在4.0×1011cfu/g以上，這一階段正是木質纖維素被快速腐解的時期，說明在稻稈腐解前期中細菌可能起主要作用。

16S rDNA-DGGE結合克隆測序共得到12個測序結果。在稻稈腐解過程中，不同腐解時期細菌的組成也呈現(xiàn)出多樣性，變化也較為明顯。其中，Pseudomonas stutzeri(X98607.1)、Uncultured bacterium clone R2J3M4_C5(GQ467097.1)、Rhodanobacter sp.LAA-2009-i12(FN298498.1)、Uncultured planctomycete clone Jx19-28(GQ443676.1)、Bacillus sp.IWF41(GU120654.1)、Uncultured bacterium clone A-6(EF579784.1)和Uncultured bacterium clone areia_48(GQ996480.1)為優(yōu)勢菌株，它們貫穿于稻稈腐解的整個過程;Pseudotrichomonas sp.2003-5005(DQ412644.1)在腐解的前期起作用，而后迅速消失;Alcaligenes sp.(FJ531636.1)和Klebsiella pneumoniae(EU078621.1)在腐解的后期才出現(xiàn)而起作用，而Uncultured bacterium clone C_M_03_11(FJ470745.1)則是交叉出現(xiàn)的。

復合菌系RSS-4的18S rDNA-DGGE結合克隆測序的結果顯示，最少有18種真菌參與到稻稈的腐解。在稻稈腐解過程中，不同腐解時期真菌的組成呈現(xiàn)出多樣性，變化差異也較為明顯。其中，Telotrochidium matiense strain CCAP 1655/2(AY611065.1)、Uncultured eukaryote clone EC72(AY817011.2)、Uncultured eukaryote clone EUKDPK69(DQ104585.1)、Telotrochidiummatiense(EF417835.2)、Petalomonas cantuscygni CCAP 1259/1(AF386635.1)、Graphiumpenicillioides strain HSAUP042563(FJ914664.1)、Bodo sp.coconut/BRA/1988(FJ839605.1)和18 Ochromonadaceae environmental sample clone Elev_18S_1192(EF024705.1)為優(yōu)勢菌株;而Uncultured eukaryote clone EC37(AY817000.2)、Uncultured eukaryote clone DLN-J-70(FJ848498.1)、Leukarachnion sp.ATCC PRA-24(FJ356265.2)、Honigbergiella ruminantium strain KOJ14(AY319280.1)和Geomyces destructans isolate 20674-10(FJ231102.1)在腐解的前期起作用，而后迅速消失;Uncultured fungus(AB262844.1)、Uncultured fungus clone T3_II_2a_21(EF628587.1)、Mucor circinelloides(AM745433.1)、Unculturedeukaryoteclone D2P04B10(EF100248.1)和Spumella sp.Mbc_3C(AB425951.1)在腐解的后期才出現(xiàn)而起作用。

以上結果表明采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和PCRDGGE技術可以較好地對水稻秸稈腐解復合菌系RSS-4在腐解過程中菌種區(qū)系變化情況進行分析。研究發(fā)現(xiàn)有多株細菌和多株真菌存在于稻稈腐解過程中，且區(qū)系變化較為明顯。腐解過程中不同時期由不同優(yōu)勢菌株扮演重要角色共同促進了稻稈的腐解，所有這些結果為秸稈腐解菌劑工藝的生產(chǎn)和應用提供分子生態(tài)學依據(jù)。

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