2,4-D對小麥胚愈傷組織誘導及其形成的影響

鄒亞麗，王廷璞，劉瑞媛，馬偉超，李一婧

（天水師范學院 生命科學與化學學院，甘肅 天水 741001）

2,4-D對小麥胚愈傷組織誘導及其形成的影響

鄒亞麗，王廷璞，劉瑞媛，馬偉超，李一婧

（天水師范學院 生命科學與化學學院，甘肅 天水 741001）

為建立有效的小麥細胞誘導再生培養體系，以中梁22小麥幼胚和成熟胚為材料，分別在含不同濃度2,4-D的HB和MS培養基上進行組織培養，研究其對小麥幼胚和成熟胚愈傷組織形成的影響.結果表明：不同濃度2,4-D的處理之間存在顯著差異，濃度為0.5mg/L的2,4-D的誘導率最高達到78.6%，有利于形成胚性愈傷組織；不同培養基之間差異顯著，HB培養基的誘導率高于MS培養基；不同外植體之間差異不顯著.

小麥；幼胚；成熟胚；愈傷組織

小麥作為重要的糧食作物，在世界范圍內的種植面積和總量均超過其他農作物，在我國小麥的種植面積和總產量僅次于水稻.小麥蛋白質含量可達其干重的10%，是人類蛋白質的主要攝入來源.但在小麥的生產過程中，因不斷受到生物、非生物等因素的脅迫，嚴重影響了其產量和品質.隨著現代生物技術的發展，應用基因工程技術對小麥進行品種改良越來越受到重視.自20世紀80年代人們開始研究轉基因植物以來，利用轉基因等生物技術對小麥進行抗蟲、抗病、抗逆及品質改良等方面已取得較大進展.[1]但在小麥組織培養體系中，外植體離體再生頻率低，因此研究小麥組織培養條件和植株再生頻率的影響因素仍然是小麥轉基因育種技術的重要課題之一.近年來，研究者對影響小麥組織培養的因素如基因型、外植體來源、培養基類型及成分等進行了大量的研究.[2-12]研究表明，2,4-D是誘導禾本科植物體細胞發生的重要因素[13]，不同的外植體和培養基同樣也影響著小麥愈傷組織的誘導.[14]本文對天水地區主栽小麥品種中梁22號的幼胚和成熟胚進行了組織培養，研究了不同外植體、培養基和激素對愈傷組織誘導的影響，目的在于為小麥育種尋求較好的轉基因受體并建立成熟的小麥再生體系奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為中梁22號，天水市農科所中梁站提供.

1.2 方法

1.2.1 成熟胚愈傷組織的誘導

將選好的小麥種子用無菌水洗5～8遍后在室溫下浸泡約12h，在超凈工作臺上用70%酒精將泡好的種子浸10s后用無菌水洗3遍，再用0.1%的HgCl2滅菌15min后用無菌水洗5遍.用解剖刀將處理好的小麥放入預先滅完菌的培養皿中剝取胚，移胚時將胚夾破，盾片朝上分別接入誘導愈傷組織培養基中培養.培養室溫度為25℃，光源為日光燈，每天光照12h，誘導愈傷組織時用散射光.[15]

1.2.2 幼胚愈傷組織的誘導

取開花15d左右的小麥幼穗放入預先滅完菌的空錐形瓶中用70%的酒精浸泡20s，倒出酒精用無菌水沖洗3次后再用HgCl2泡5min，最后用無菌水沖洗3遍.用鑷子或解剖針剝開葉鞘取出幼胚，盾片朝上接于誘導培養基上進行暗培養.

1.3 培養基

本實驗采用的是MS培養基和HB培養基，每種培養基均添加0.5mg/L、2.0 mg/L和3.0 mg/L3個不同濃度水平的2,4-D，共六種培養基.

1.4 統計方法

愈傷組織誘導率計算公式：愈傷組織誘導率=(誘導愈傷組織數/離體胚數)×100%.

利用最小差數檢驗法和t檢驗法處理實驗數據.

2 結果與分析

2.1 不同外植體對小麥愈傷組織誘導的影響

小麥幼胚愈傷組織在接種6d后長出愈傷組織，誘導出的愈傷組織在形態上主要有兩種類型：一種為白灰色水浸狀愈傷組織，較少；另一種為淡黃致密型胚性愈傷組織，居多.成熟胚接種2d后，離體胚有出芽現象；4d后大多數離體胚都能看到明顯的半透明狀的愈傷組織.雖然小麥幼胚的誘導率高于小麥成熟胚的誘導率（見表1），但方差結果表明小麥幼胚與成熟胚愈傷組織誘導率的差異并不顯著（見表2）.

表1 不同外植體對小麥愈傷組織誘導的影響

表2 不同外植體對小麥愈傷組織誘導影響的t檢驗結果

2.2 2,4-D對小麥愈傷組織誘導的影響

由表3可知，培養基中添加的2,4-D濃度不同，愈傷組織的類型、質地、顏色和生長狀況等都有較大差異；濃度為0.5mg/L的2,4-D培養基誘導率最高.通過最小顯著差數法比較（見表4）可知，濃度為0.5mg/L的2,4-D的誘導率最高，濃度為2.0mg/L和3.0mg/L的2,4-D培養基之間差異不顯著.

表3 不同2,4-D濃度對小麥愈傷組織誘導的影響

表4 不同2,4-D濃度對小麥愈傷組織誘導影響的方差分析表

2.3 不同培養基對小麥愈傷組織誘導的影響

由表5和表6可知，HB培養基和MS培養基對小麥愈傷組織誘導有顯著差異.實驗中發現，在HB培養基上，不論是小麥幼胚還是成熟胚均大約在2～5d左右即可誘導產生愈傷組織，而在MS上則需要大約8～9d才可誘導產生愈傷組織；所產生的愈傷形態主要有淡黃致密和白至灰色松軟兩種；在同一種培養基上，不同外植體的愈傷組織誘導率和愈傷組織的質量相差不大.

表5 不同培養基對小麥愈傷組織誘導的影響

表6 不同培養基對小麥愈傷組織誘導的影響的方差分析表

3 討 論

3.1 小麥愈傷組織誘導外植體的選擇

愈傷組織的誘導和增殖主要依賴于外植體本身、培養基和培養條件三方面因素的共同作用.在目前的組織培養技術條件下，選擇適宜的外植體和培養基是主要的研究內容.其中在外植體的選擇方面，除基因型之外，外植體的生長發育階段和生理狀態是人們較難控制的，因而對外植體的篩選是植物組織培養中的關鍵技術.目前，誘導小麥胚性愈傷組織的外植體包括幼胚、幼穗、花藥、成熟胚等，其中幼胚因其具有容易產生胚性愈傷組織且再生能力較強等優點而得到了廣泛應用.[16]成熟胚與幼胚相比，雖然愈傷組織的芽分化頻率較底，但因其易于獲取，不受季節植株發芽時期的限制，具備取材方便、操作簡單、愈傷組織成長快和一次成苗率高等特點已得到廣泛的研究和應用.[17-19]

本研究發現，幼胚比成熟胚易于誘導，這是由于幼胚組織比較幼嫩，接近于胚性細胞，因此更加容易脫分化.但小麥幼胚愈傷組織的褐變現象較嚴重，其可能有兩方面的原因：一是半透明狀的愈傷組織含水量大，在轉移過程中容易造成機械損傷；二是培養基中的激素成分對愈傷組織造成了一定傷害.[15]同時，小麥幼胚的生長發育階段和生理狀態也會對愈傷組織的誘導、增殖和愈傷組織的質量產生重要影響.本實驗還發現，在成熟胚愈傷組織的誘導過程中，把成熟胚夾破有助于愈傷組織的形成.

3.2 2,4-D濃度在小麥愈傷組織誘導中的確定

2,4-D是大多數植物離體培養誘導愈傷組織最有效的物質，它能誘發細胞分裂活動，引起細胞脫分化和無序增殖，產生愈傷組織.在以前的研究報道中，大多數認為2.0mg/L的2,4-D是小麥成熟胚和幼胚誘導愈傷組織的適宜濃度.[20-22]而通過本實驗表明，0.5mg/L的2,4-D對小麥愈傷組織的誘導率最高，這和趙永英等人對鄭麥9203胚性愈傷組織誘導的研究結果是一致的.[11]通過方差分析表明，三種濃度的2,4-D對小麥愈傷組織出愈數的影響顯著，而2mg/L與3mg/L的2,4-D對小麥愈傷組織誘導的影響差異并不顯著，這也許與小麥的基因型有關。因此，確定適宜的外源激素及其濃度對小麥愈傷組織的影響還有待于進一步的研究.

3.3 不同培養基對小麥愈傷組織誘導的影響

由于不同培養基所含的各種營養成分和激素種類有所不同，從而直接地影響著愈傷組織的形成、增殖和愈傷組織的質量.因此，必須根據所需誘導的外植體選擇相應的培養基.本實驗結果表明，在誘導效果上，不論是幼胚還是成熟胚的愈傷組織的誘導，在HB培養基誘導的愈傷組織生長快、體積大、色澤鮮潤，質量、生長量等指標均優于MS培養基誘導的愈傷組織.

3.4 其他因素對小麥愈傷組織誘導的作用

在組織培養中，避免污染是獲得理想結果的關鍵.因此，接種和培養都要求在嚴格的無菌條件下操作.在本實驗中，出現了一些染菌情況，且多為霉菌和細菌.此外，盾片的接入方式也會影響愈傷組織誘導率和愈傷組織的質量，并會對分化產生一定的影響.

總之，小麥愈傷組織的誘導是一個復雜的連續的體系，針對某一個方面進行單一因素的研究勢必要受到其他因素的影響.因此，在今后的相關研究中，應該綜合考慮多種因素對小麥愈傷組織的誘導率和胚性愈傷組織形成的影響.

[1] 趙慧,徐萍,牛燦芳.小麥轉基因研究現狀及展望[J].科學前沿與學術評論,2005,27(3)：32-36

[2] 梁靜靜,呂德彬,陳軍營,等.不同基因型對小麥成熟胚愈傷組織誘導及植株再生的影響[J].河南農業大學學報,2003,37(2)：107-114.

[3] 李根英,黃承彥,隋新霞,等.小麥不同外植體的組織培養研究[J].麥類作物學報,2006,26(1)：21-25.

[4] 孫果忠,馬民強.一種適于小麥愈傷組織誘導與繼代培養的培養基[J].河北農業科學,1996,3(2)：24-26.

[5] 尹鈞,任江萍,宋麗,等.小麥不同轉基因受體材料的植株再生研究[J].麥類作物學報,2004,24(2)：1-4.

[6] 蔡黎明.小麥單倍體幼胚離體培養研究[J].中國農學通報,2006,22(7)：313-315.

[7]SHOHAEL AM,AKANDA MAL,PARVEZ S,et al.Somatic embryogenesis and plant regene-ration from immature embryo derived callus of inbred maize(ZeamaysL.)[J].Biotechnology,2003,2(2)：154-161.

[8] AN H L,WEI Z M,HUANG J Q.High efficiency regeneration of wheat plants from immature embryos[J].Acta Phytophysiol.Sin,2000,26(6)：532-538.

[9] CASWELL K L.An efficient method for in vitro regeneration from immature inflorescence explants of Canadian wheat cultivars[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2000,60(1)：69-73.

[10]孫巖.提高小麥幼胚組織培養效果的初步研究[J].黑龍江農業學,2004,(1)：25-27.

[11]趙永英,李翠香,苗紅梅.影響小麥組織培養效率的重要因素研究[J].河南農業科學,2007,(1)：23-26.

[12]PATNAIK D,KHURANA P.Genetic transformation of Indian bread(T.aestivum)and pasta(T.durum)wheat by particle bombardment of mature embryo-derived calli[J].BMC Plant Biology,2003,3(5)：461-471.

[13]伍碧華,鄭有良,周永紅,等.四川小麥幼胚脫分化特性研究[J].麥類作物學,2001,(2)：25-30.

[14]劉香利,劉縉,郭藹光,等.小麥幼穗的離體培養及其影響因素研究[J].西北農林科技大學學報,2007,35(2)：79-82.

[15]楊淑慎,郭振,徐虹.小麥胚愈傷組織的誘導和植株再生[J].西北農業學報,2002,11(4)：46-48.

[16]范學科,王亞紅,奚亞軍,等.小麥幼胚愈傷組織誘導影響因素的研究[J].農業生物技術科學,2007,(11)：68-71.

[17]MARIA G,HEIDI F.Auxin and sugar effects on callus induction and plant regeneration frequencies from mature embryos of wheat[J].In Vitro Cellular&Developmental Biology,2002,38(1)：39-46.

[18]何勇剛,郭振,徐虹.小麥胚愈傷組織的誘導和植株再生[J].西北農業學報,2002,(4)：46-48.

[19]賀杰,常景玲.小麥成熟胚愈傷組織的誘導及植株再生體系的研究[J].安徽農業科學,2007,35(5)：1280-1281.

[20]周淼平,黃益洪.低濃度2,4-D及外源激素誘導小麥體細胞快速成苗[J].江蘇農業學報,2000,16(3)：139-142.

[21]谷立坤,張建云,張世敏,等.不同質量濃度2，4-D對硬粒小麥成熟胚愈傷組織誘導及植株再生的影響[J].河南農業大學學報,2004,12(4)：452-455.

[22]趙占軍,陳茂盛,王貴娟.胚齡和激素對小麥幼胚組織培養的影響[J].生物技術,2003,5(7)：7-8.

S512.1+1

A

1671-1351（2011）02-0033-03

2010-08-22

鄒亞麗 (1971-)，女，甘肅天水人，天水師范學院生命科學與化學學院講師，碩士.

天水師范學院科研基金資助項目“小麥轉β-1,3-葡聚糖酶及幾丁質酶基因抗條銹的研究”（TSA0624）階段性成果

〔責任編輯 馬旭光〕