RP-HPLC法同時測定中藥關白附中關附甲素、關附壬素和關附辛素含量

吳 瓊， 楊春華， 劉靜涵， 秦民堅*

(1.中國藥科大學中藥資源教研室，江蘇 南京210009;2.中國藥科大學天然藥物化學教研室，江蘇南京210009;3.中國藥科大學分析測試中心，江蘇南京210009;4.教育部藥物質量與安全預警重點實驗室，江蘇南京210009)

關白附為毛茛科烏頭屬植物黃花烏頭(Aconitum coreanum(Lèvl)Rapaics)的塊根，為常用中藥，具有祛風、燥濕、化痰、止痛等功效。其主要活性成分為二萜生物堿，迄今已分離得到其中28個二萜生物堿，包括25個C20和3個C19二萜生物堿，其中關附甲素(GFA，1)為叔胺類C20Hetisine型二萜生物堿，有抗多種實驗性心率失常作用，并已進入我國一類新藥的Ⅳ期臨床實驗［1-4］;關附壬素(GFI，2)為其另一含量較高的二萜生物堿，與GFA相比，具有相同的母核，但酰基數目較少，活性較弱［5-6］;關附辛素(GFH，3)為水溶性Atisine型生物堿，又名atisine chloride［7］，能抑制骨骼肌系統和呼吸系統，具高毒性，對小鼠的LD50為9.0 mg·kg-1［8］，且其在關白附藥材中含量較高，是藥材質量控制的指標性成分之一。本文首次采用反相高效液相色譜法同時對關白附中3種生物堿——GFA、GFI和GFH進行含量測定，獲得滿意結果，為藥材質量控制提供了實驗依據。

1 儀器與材料

Agilent 1100 system(G1311A四元梯度泵，G1313A自動進樣器，G1315B-DAD二極管陣列檢測器，Agilent公司);Agilent色譜工作站;AE240分析天平(METTLER公司);0412-1離心機(上海手術器械廠);KQ-250DE型醫用數控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);RT-02藥材粉碎機(浙江武義屹立工具有限公司)。

乙腈(色譜純，Merck公司);磷酸，三乙胺(分析純，南京化學試劑廠);純凈水(樂百氏公司);GFA、GFI、GFH對照品(自制，結構經UV、IR、NMR、MS鑒定，純度經HPLC峰面積歸一化法測得大于98%)。

關白附藥材樣品(批號0701～0705，為2007年10月中旬采收的3年生藥材;批號0801～0805，為2008年10月中旬采收的2年生藥材)，由吉林敖東洮南藥業提供，中國藥科大學中藥學院秦民堅教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物黃花烏頭的塊根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Zorbax Eclipse XDB-C8柱(2.1 mm×150 mm，5μm);流動相A:0.2%庚烷磺酸鈉緩沖液(加入0.2%三乙胺，磷酸調至pH 3)，流動相B:乙腈;梯度洗脫:流動相B體積分數在0～10 min時為10%，10～25 min時為10%～17%，25～60 min時為32%;流速:0.2 mL·min-1;檢測波長:205 nm;柱溫:25℃;進樣量:10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取對照品GFI 24.8 mg、GFA 25.2 mg、GFH 25.0 mg，分別置50 mL量瓶內，用流動相A溶解并定容，搖勻，制得GFI(0.496 g·L-1)、GFA(0.504 g·L-1)和GFH (0.500 g·L-1)的對照品儲備液。取對照品 GFI儲備液2.5 mL、GFA儲備液2.5 mL和GFH儲備液5.0 mL，分別置5 mL量瓶中，加流動相A稀釋，即得GFI(0.248 g·L-1)、GFA(0.252 g·L-1)和GFH(0.500 g·L-1)的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取關白附藥材樣品粉末約2 g，過24目篩(孔徑為0.8 mm)，精密稱重，加入50 mL 1%HCl，稱重，80 Hz超聲30分鐘，放冷，加入1%HCl補足失重，搖勻，移取4 mL置離心管，離心(4 000 r·min-1)30 min，移取上清液，過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.3 系統適用性試驗

按“2.1”項下色譜條件，取供試品溶液，進樣，記錄色譜圖(見圖1)。結果測得，理論塔板數以GFI計不低于10000;3種生物堿色譜峰的對稱因子在0.95～1.05之間，其相鄰色譜峰的分離度大于1.5。

圖1 供試品溶液色譜圖Figure 1 Chromatogram of sample solution

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密量取各對照品儲備液2、4、6、8、10 mL，分別置10 mL量瓶中，以流動相A稀釋定容，制成系列標準溶液，進樣，記錄色譜圖。以峰面積(A)為縱坐標，質量濃度(C)為橫坐標，進行回歸計算，分別得GFI、GFA和GFH的回歸方程: AGFI=5.0×103C+1.8×102(r=0.999 9)，AGFA= 4.0×103C-1.5×102(r=0.999 9)，AGFH=8.2×103C-3.7×102(r=1.000);其質量濃度線性范圍分別為:0.100～0.502 g·L-1，0.100～0.498 g·L-1，0.100～0.500 g·L-1。

2.4.2 重復性試驗 取同一批次關白附藥材樣品(批號:0805)6份，分別按“2.2.2”項下操作，制成供試品溶液，進樣，記錄色譜圖。結果測得，關白附藥材中GFI、GFA和GFH含量的RSD(n=6)分別為1.20%、1.85%和1.41%，其保留時間的RSD(n= 6)均小于0.5%。表明此方法重復性良好。

2.4.3 精密度試驗 取關白附藥材樣品(批號: 0801)1份，同法制成供試品溶液，連續進樣6次，記錄色譜圖。結果測得，關白附藥材中GFI、GFA和GFH含量的RSD(n=6)分別為0.11%、0.23%和 0.14%，其保留時間的RSD(n=6)均小于0.5%。表明此方法精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取關白附藥材樣品(批號: 0801)1份，同法制成供試品溶液，分別在室溫放置0、6、12、18、24 h時，進樣，記錄色譜圖。結果測得，在不同時間點的GFI、GFA和GFH峰面積的RSD (n=5)分別為0.42%、1.27%和0.18%，其保留時間的RSD(n=5)均小于0.5%。表明供試品溶液在室溫放置24 h內穩定。

2.4.5 回收率試驗 取已知含量的同一批次關白附藥材樣品(批號:0702)約1 g，共9份，精密稱定，每3份樣品中分別加入混合對照品溶液［含GFI(4.75 g·L-1)、GFA(7.01 g·L-1)和 GFH (8.90 g·L-1)］0.80、1.00和1.20 mL，同法制成供試品溶液，進樣，記錄色譜圖。結果測得，關白附藥材中GFI、GFA和GFH的平均加樣回收率分別為97.29%、101.46%和102.33%，RSD(n= 9)分別為3.29%、1.40%和2.42%。

2.5 樣品測定 稱取不同批次的關白附藥材樣品適量，同法制得供試品溶液，同時取“2.2.1”項下各對照品溶液，分別進樣，記錄色譜圖，平行操作3次。取平均值，按外標法計算樣品平均含量，結果見表1。

表1 樣品含量測定結果(mg·g-1，±s，n=3)Table1 Results of the content determination for samples

表1 樣品含量測定結果(mg·g-1，±s，n=3)Table1 Results of the content determination for samples

樣品批號GFI GFA GFH 0701 5.13±0.09 8.20±0.08 9.43±0.12 0702 5.05±0.04 7.10±0.08 8.53±0.10 0703 5.11±0.04 7.95±0.05 8.04±0.12 0704 5.59±0.04 8.65±0.02 10.08±0.18 0705 4.75±0.10 7.94±0.18 8.93±0.24 0801 5.25±0.06 5.76±0.11 6.27±0.09 0802 5.36±0.02 5.42±0.06 6.36±0.03 0803 5.96±0.11 5.94±0.05 5.94±0.03 0804 5.37±0.10 5.56±0.03 6.66±0.12 ___0805_______4.29±0.07___6.33±0.1___________________ 65.81±0.08

3 討論

本文采用超聲方法［9］，提取關白附中的主要成分二萜生物堿，發現其2年生與3年生藥材中GFI、GFA、GFH含量存在明顯差異，其中批號為0803的樣品中GFI含量最高，批號為0704的樣品中GFA和GFH含量最高。即總體來說，3年生藥材中，GFA和GFH含量明顯高于2年生藥材，總堿含量也較高，這揭示了民間多采用3年生藥材的塊根入藥的原因。

目前文獻報道的關白附質量控制方法大多采用指紋圖譜考查及GFA的HPLC法含量測定［10］，而尚未見同時測定活性成分GFA與強毒性成分GFH含量的報道。眾所周知，中藥起效的物質基礎極其復雜，對單一活性成分的測定不能說明藥材的效用本質。本文通過對關白附中3種二萜生物堿的含量測定，發現同批次藥材中GFH含量大多高于GFA含量。因此，可對藥材進行適當的炮制或有效的提取制備，減少其中毒性成分的含量，從而達到控制藥材質量和安全用藥的目的。

本文所建立的同時測定3種生物堿——GFI、GFA和GFH的HPLC法，線性范圍寬，重復性好，可用于關白附藥材的質量控制。

［1］ 吳貽谷，宋立人.中華本草［M］.上海:上海科學技術出版社，1998:499.

［2］ 后德輝，李玲，王秋娟，等.關附甲素對實驗性心率失常的作用［J］.中國藥科大學學報，1981，17(2):68-74.

［3］ 董月麗，陳維洲.關附甲素對實驗性心率失常和心肌收縮性的影響［J］.藥學學報，1995，30(8):577-582.

［4］ 薛姣，楊春華，劉靜涵，等.烏頭屬植物二帖類生物堿研究進展［J］.海峽藥學，2009，21(2):1-10.

［5］ Huang Q，Wang G J，Sun JG，etal.Simultaneous determination of GFA and its activemetabolites in human plasma by liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry and its application to pharmacokinetic studies［J］.J Pharm Biomed Anal，2008，46(4): 728-736.

［6］ 王如斌，彭司勛，華維一.關附甲素的結構修飾［J］.中國藥科大學學報，1992，23(5):257-259.

［7］ 劉靜涵，陳翔飛.關附素的結構鑒定［J］.中國藥科大學學報，1985，16(3):58-60.

［8］ Dzhakhangirov FN，Bessonova IA.Alkaloids of Aconitum coreanum.X.Curare-like-structure relationship［J］.Chem Nat Comp，2002，38(1):74-77.

［9］ 王嚇長，王強，劉靜涵.關白附的HPLC指紋圖譜［J］.中國天然藥物，2005，3(5):294-297.

［10］馮鋒，黃劍，劉靜涵.RP-HPLC法測定不同采收期黃花烏頭中關附甲素的含量［J］.中草藥，1999，30(7): 495-496.