RP-HPLC法同時測定不同產地紅參中 6種人參皂苷的含量

劉 丹 , 濮社班 , 朱玲英 , 錢士輝＊

(1.江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥化學研究室,江蘇南京 210028;2.中國藥科大學生藥學研究室,江蘇南京 211198)

紅參是由五加科植物人參 (Panax ginseng C.A.M eyer)的栽培品經蒸制后所得的干燥根和根莖[1]。人參皂苷是其最主要的有效成分之一[2],也是判斷其質量優(yōu)劣的重要指標之一。目前國內外采用高效液相色譜法測定紅參中人參皂苷的研究報道較多[3-7]。2010年版《中國藥典》(一部)紅參項下要求對其主要成分 Rg1、Re和 Rb1的含量進行測定[1]。此外,Ro也是紅參中人參皂苷的主要成分之一,其含量對紅參藥材質量的評價有重要意義[4]。本課題組從紅參中分離得到了人參皂苷Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro。本文采用反相高效液相色譜法同時測定不同產地紅參中上述各皂苷成分的含量,旨在為紅參藥材質量標準的提高提供依據。

儀器與試藥

1.1 儀器

W aters2695高效液相色譜儀(四元泵自動進樣系統(tǒng));W aters 2996二極管陣列紫外檢測器; Empower化學工作站(美國沃特世公司);M ETTLER TOLEDO AT-201十萬分之一電子天平 (梅特勒-托利多儀器上海有限公司);BUCH IR-200旋轉蒸發(fā)儀(瑞士步琪公司);KQ-500B型超聲波清洗器 (功率: 250W,頻率:50 kHz,昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

人參皂苷 Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro對照品均為自制,歸一化法測得其純度均大于 98%。不同產地藥材共 10批,購于吉林 (集安、撫松、通化北、長白山、汪清縣、安圖、靖宇)和遼寧 (撫順、本溪、新賓),經江蘇省中醫(yī)藥研究院錢士輝研究員鑒定為紅參。乙腈(美國 TED IA公司)、甲醇 (江蘇漢邦科技有限公司)均為色譜純;磷酸為分析純;水為重蒸餾水(M illi-Q純水器制得)。

方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為 A lltim aTM-C18(250 mm×4.6 mm, 5μm),流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脫(0～35 m in,19%乙腈;35～55 m in,19%乙腈→29%乙腈;55～60 m in,29%乙腈;60～85 m in, 29%乙腈→40%乙腈);流速:1.0 m L·m in-1;檢測波長:203 nm;柱溫:30℃,進樣量:10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取已干燥至恒重的人參皂苷 Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和Ro對照品各約5m g,精密稱定,分別置 5mL容量瓶中,以甲醇溶解稀釋并定容至刻度,搖勻,即分別得人參皂苷 Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro對照品儲備液。取 10m L量瓶一只,分別精密加入上述對照品儲備液 2.0、0.5、0.5、2.5、1.0和 2.5mL,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,得混合對照品溶液,上述各成分質量濃度分別為 0.201、0.051、0.052、0.253、0.102和 0.256 g·L-1。

2.2.2 供試品溶液的制備 取紅參粉末 (過 4號篩,孔徑 4.75mm)約 1 g,精密稱定,置索氏提取器中,加三氯甲烷適量,加熱回流 3 h,棄去三氯甲烷液,藥渣揮干溶劑,連同濾紙筒移入具塞錐形瓶中,精密加入水飽和的正丁醇 50mL,密塞,放置過夜,超聲處理 30m in,濾過,精密吸取續(xù)濾液 25 m L,置蒸發(fā)皿中蒸干,殘渣加甲醇溶解并轉移至5mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

按“2.2”項下方法制得混合對照品和供試品溶液,并按“2.1”項下條件進樣測定,結果顯示,混合對照品中各人參皂苷的保留時間與供試品中的一致,供試品中各人參皂苷成分達到有效分離。結果見圖1。

圖1 Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro對照品及紅參樣品色譜圖Figure 1 HPLC chrom atogram sof reference substancesof Rg1,Re,R f,Rb1,Rc,Ro and samp le of red ginseng

2.4 線性關系的考察

分別精密吸取“2.2.1”項中制備的混合對照品溶液 3、10、15、20、25和 30μL,進樣測定,記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標 (Y),待測組分的質量 (μg)為橫坐標(X),繪制標準曲線并進行線性回歸。結果顯示,Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro的質量分別在0.603～6.03μg、0.153～1.53μg、0.157～1.57μg、0.758～7.58μg、0.306～3.06μg和 0.768～7.68μg范圍內時,質量與峰面積均呈良好的線性關系,線性方程分別為:

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項中制備的混合對照品溶液10μL,連續(xù)進樣 6次,測定峰面積,結果得 Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro峰面積的 RSD(n=6)分別為1.0%、1.3%、1.8%、1.2%、1.4%和 1.2%。表明本方法精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一產地(吉林靖宇)藥材 1.0 g,精密稱定,平行 6份,按“2.2.2”項下方法制得供試品溶液,進樣測定,結果得Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro含量的平均值(n=6)分別為 0.230%、0.044%、0.064%、 0.344%、0.130%和 0.364%,RSD分別為 1.3%、1.5%、1.7%、0.8%、1.7%和 1.0%。表明本方法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一產地 (吉林靖宇)藥材,按“2.2.2”項下方法制得供試品溶液,分別于 0、2、4、8、12 h進樣,測定峰面積,結果得 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc和Ro峰面積的 RSD(n=5)分別為 1.4%、1.3%、1.9%、0.90%、1.8%和 1.1%。表明供試品溶液在 12 h內基本穩(wěn)定,本方法有良好的穩(wěn)定性。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的紅參粉末 (吉林靖宇),過 4號篩,取約 0.5 g,精密稱定,人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc和 Ro的含量分別為 0.228%、0.044%、0.063%、0.339%、0.130%和 0.302%,分別加入Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro對照品 1.140、0.219、0.316、1.705、0.650和 1.510 m g,平行 6份,按“2.2.2”項下方法制備回收率測試溶液,進樣測定,結果得人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc和 Ro平均回收率 (n=6)分別為 101.3%、99.2%、98.1%、97.6%、100.7%和 99.0%,RSD分別為 0.41%、2.03%、1.03%、0.33%、2.31%和 1.87%。

2.9 樣品含量測定

取不同產地的樣品各 3份,精密吸取按“2.2.2”項下方法制備的供試品溶液,進樣測定,按外標法計算樣品中 Rg1、Re、R f、Rb1、Rc和 Ro的平均含量,結果見表1。

表1 不同產地紅參中人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc和 Ro的平均含量(n=3)Tab le 1 Determ ination resultsof ginsenosidesRg1,Re,R f,Rb1,Rc,Ro in red ginseng of differentorigins

討論

本試驗分別比較了索氏脫脂后超聲提取、加熱回流提取、超聲提取 3種不同方法的提取效果,結果發(fā)現(xiàn)按藥典方法進行脫脂后超聲提取效果較好。

對乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液 2種不同流動相的考察結果表明,以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時可獲得較好的分離效果,原因可能是人參皂苷Ro為齊敦果烷型酸性皂苷,加入0.1%磷酸可改善峰形。人參皂苷 Rg1、Re的結構相似,保留時間非常相近,故較難分離,經反復摸索,發(fā)現(xiàn)在50m in左右才能完全達到基線分離;比較不同梯度下的色譜圖,僅在“2.1”項中所用梯度下各成分均能達到基線分離,其他梯度條件雖能縮短分析時間,但各成分不能達到基線分離,故此梯度為最佳條件。

本實驗對10批藥材中的人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Ro的含量測定結果顯示,Rg1、Re和 Rb1的含量分別介于 0.189%～0.236%、0.045%～0.137%和 0.215%～0.654%,表明不同產地的紅參藥材中人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量均能達到2010年版《中國藥典》紅參項下的要求[1]。另 3種人參皂苷 Rf、Rc和 Ro的含量分別介于 0.030%～0.089%、0.106%～0.275%和 0.139%～0.576%。表2結果顯示,吉林長白山所產紅參中 6種皂苷的總量較高,遼寧新賓所產紅參中 6種皂苷的總量偏低;此外,不同產地人參皂苷Rb1、Ro的含量差異也較大。

荊淑芹等[6]測定了紅參中 Rb2、Rd等 7種人參皂苷的含量,未報道人參皂苷 Ro的含量。本實驗未從紅參樣品中檢出人參皂苷 Rb2、Rd,也未分離純化到 Rb2、Rd的對照品;而從樣品中某一成分與標準品中 Ro的保留時間和吸收光譜值相同,且在樣品中加入標準品 Ro后樣品中該成分色譜峰的峰面積增大等現(xiàn)象可確定樣品中該成分為 Ro。以上結果的差異可能與紅參產地的生態(tài)環(huán)境及紅參的種植、采收、加工炮制有關,應重視人參的種植、采收、加工炮制等的進一步規(guī)范化研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:143.

[2] 楊秀偉.紅參的化學、藥理和臨床研究進展[J].中成藥研究,1984,28(5):30-33.

[3] Sam ukawa Keiichi,Yamashita H ideyuki,M atsuda H ideaki,et a l.Sim ultaneous analysis of saponins in Ginseng Rad ix by high perform ance liquid chrom atography[J].Chem Pharm Bu ll,1995,43(1):137-141.

[4] Sam ukawa Keiichi,H ideyuki Yam ashita,M atsuda H ideaki,et a l.Sim u ltaneous analysis of ginsenosides of various ginseng radix by HPLC[J].Yakugaku Zasshi,1995,115 (3):241-249.

[5] W ashida Daisuke,Kitanaka Susum u.Determ ination of polyacetylenes and ginsenosides in Panax species using high perform ance liquid chrom atography[J].Chem Pharm Bu ll,2003,51(11):1314-1317.

[6] 荊淑芹,姜海平,劉鳳云,等.生曬參紅參林下參中 7種人參皂苷含量的比較 [J].中華中醫(yī)藥學刊,2009, 27(1):207-209.