乳糖發酵短桿菌lysC突變對L-賴氨酸積累的影響

董迅衍, 徐大慶, 李燁, 李江華, 王小元＊

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫 214122;2.江南大學生物工程學院,江蘇無錫 214122)

乳糖發酵短桿菌lysC突變對L-賴氨酸積累的影響

董迅衍1, 徐大慶1, 李燁1, 李江華2, 王小元＊1

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫 214122;2.江南大學生物工程學院,江蘇無錫 214122)

從一株乳糖發酵短桿菌L-異亮氨酸生產菌中克隆出天冬氨酸激酶A K-1的編碼基因lysC1,經DNA測序并與來自谷氨酸棒桿菌A TCC13032的野生型lysC比對發現其中有2個核苷酸1186G和1187C缺失,造成翻譯提前終止。A K-1還有下列2個有效突變位點:A la 279 Thr和Ser 317 A la。lysC1在大腸桿菌BL21中的誘導表達量約為lysC的1/4,其表觀比酶活也較低,但對L-蘇氨酸和L-賴氨酸協同反饋抑制不敏感。用大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭表達載體pDXW-8將lysC1在野生型乳糖發酵短桿菌A TCC13869中誘導型表達,經搖瓶發酵積累L-賴氨酸7.4 g/L,在3 L發酵罐上達40 g/L。

乳糖發酵短桿菌;天冬氨酸激酶;抗反饋抑制;發酵;L-賴氨酸

L-賴氨酸為高等動物必需的8種氨基酸之一,在飼料、食品、醫藥行業應用廣泛,主要被用作動物飼料添加劑,是畜禽飼料的第一限制性氨基酸[1]。以添加了賴氨酸的低蛋白質配方飼料作為畜禽日糧,不但可以節省飼養成本,增強動物的免疫功能,提高畜禽的生產性能;還可以緩解天然蛋白質的匱乏,減少動物氨的排放,從而使環境收益與經濟收益相統一[2]。

目前,L-賴氨酸主要采用微生物直接發酵法生產,生產菌種多為棒狀桿菌,其中以親緣關系相近的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、乳糖發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)為主。這些菌株屬格蘭氏陽性菌株,由于其天冬氨酸族氨基酸(包括:賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸)合成途徑上不存在同功酶,調控機制相對簡單,因此適合用于天冬氨酸族氨基酸生產菌種的選育與構建。天冬氨酸激酶(aspartate kinase,A K)是天冬氨酸族氨基酸合成途徑上第一個關鍵酶,起控制進入天冬氨酸族氨基酸合成途徑總碳流量的作用。L-天冬氨酸經天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脫氫酶兩步酶催化反應后,即進入L-賴氨酸合成支路:經7步(有機氮源情況下)或者4步(NH4+存在時)酶催化反應最終生成L-賴氨酸[3]。A K由lysC基因編碼,野生型受終產物L-賴氨酸和L-蘇氨酸的協同反饋抑制。通過對一些經傳統育種方法選育得到的賴氨酸生產菌進行組學研究分析,發現A K是該合成途徑上影響賴氨酸產量的3個關鍵酶之一[4,5]。

作者從一株乳糖發酵短桿菌L-異亮氨酸生產菌中克隆到一個編碼抗反饋抑制A K-1的基因lysC1,測序確定了其中的突變位點。將lysC1轉入野生型乳糖發酵短桿菌ATCC13869中表達,發酵實驗結果表明L-賴氨酸產量大幅提高。本研究為構建具有最少突變位點、遺傳背景明確、生長旺盛的優勢L-賴氨酸生產菌株提供了一定的參考依據,也為構建其他天冬氨酸族氨基酸生產菌株提供了重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 乳糖發酵短桿菌ATCC13869購自美國標準生物品收藏中心(ATCC);大腸桿菌(Escherichia coli)JM 109、BL21,乳糖發酵短桿菌L-異亮氨酸生產菌以及質粒p ET28a由本實驗室保藏;大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭表達載體pDXW-8:作者所在實驗室構建[6]。

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker和ATP:上海生工生物工程有限公司產品;PrimeStar DNA聚合酶和 PCR試劑:TaKaRa寶生物公司產品;引物合成:上海生工生物工程技術服務有限公司產品;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和基因組提取試劑盒:北京天根生化科技有限公司產品;質粒小量制備試劑盒:Bio Basic Inc產品;IPTG:Sigma公司產品;酵母粉和胰蛋白胨:Oxoid公司產品;其余試劑均為國產或進口分析純。

PCR儀:Eppendo rf AG產品;電泳儀:北京六一公司產品;紫外分光光度計:日本島津產品;電轉儀:BioRad公司產品;核酸-蛋白定量儀:Gene Quant公司產品;高壓細胞破碎儀:Constant System s公司產品;高效液相色譜:Agilent公司產品;3 L發酵罐:New Brunsw ick Scientific公司產品。

1.1.3 培養基 大腸桿菌用LB培養基;乳糖發酵短桿菌A TCC13869用添加了質量分數0.5%葡萄糖的LB培養基;乳糖發酵短桿菌L-異亮氨酸生產菌用添加了質量分數0.5%葡萄糖和0.5%牛肉浸膏的LB培養基。種子培養基各組成質量分數分別為:葡萄糖2.5%,尿素0.125%,玉米漿2.0%,KH2PO40.1%,M gSO40.05%,p H 7.0。發酵培養基組成質量分數分別為:葡萄糖8%,(N H4)2SO43.5%,玉米漿 2.0%,KH2PO40.1%,M gSO40.1%,CaCO33.0%,p H 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌體培養及發酵 大腸桿菌培養溫度為37℃,乳糖發酵短桿菌為30℃;需要時,在培養基中添加30 mg/L卡那霉素。

發酵種子培養:挑一滿環新鮮斜面上的菌體接種至種子培養基,在30℃,250 r/min條件下培養15 h。種子液按質量分數8%接種量轉接發酵培養基。

搖瓶發酵:裝液量為50 m L/500 mL;分別于接種后27、51、75 h共3個時間點添加 IPTG(終濃度為30μmol/L)誘導。

上罐:裝液量為罐體積的60%;分別于接種后18、36、54 h共3個時間點添加 IPTG(終濃度為30

μmol/L)誘導[7]。罐上溶氧控制為初期30%,對數生長期50%,穩定期30%。流加體積分數25%氨水和2 mol/L HCL以控制p H值在7.0。流加葡萄糖以維持糖質量濃度在10～15 g/L[8]。

1.2.2 PCR擴增lysC和lysC1 根據谷氨酸棒桿菌A TCC13032lysC基因的上下游序列設計兩套PCR引物,F1/R1和 F2/R2,分別用于在載體p ET28a和pDXW-8中表達。正向引物F1的序列為:5’-ACTAGAA TTC GTGGCCCTGGTCGTACAGAAA TA-3’,其中下劃線表示 EcoRⅠ酶切位點;反向引物 R1的序列為:5’-ACTAGCGGCCGCGCGTCCGGTGCCTGCA TAAA-3’,其中下劃線表示NotⅠ位點。正向引物 F2的序列為:5’-AGTCGAA TTCAGAA GGA GTTTTACC GTGGCCCTGGTCGTACAGAA-3’,其中下劃線表示EcoRⅠ酶切位點,斜體字表示 SD序列,黑體表示間隔序列;下游引物 R2的序列為:5’-ACTAGCGGCCGCTTAGCGTCCGGTGCCTGCA TAAA-3’,其中下劃線表示NotⅠ位點。以乳糖發酵短桿菌A TCC13869基因組為模板PCR擴增野生型lysC;以L-異亮氨酸生產菌基因組為模板,PCR擴增突變型lysC1。

PCR擴增條件:首先在95℃預變性5 min;接著進行35個循環(95℃30 s,65℃15 s,72℃2 min);最后在72℃延伸10 min。PCR產物通過膠回收純化。

1.2.3 構建表達質粒和重組菌 首先用限制性內切酶 EcoRⅠ和NotⅠ分別對基因lysC、lysC1和載體p ET28a、pDXW-8進行處理,將處理后的載體與基因片段用 T4 DNA連接酶連接,將連接混合物轉化大腸桿菌JM 109,篩選陽性克隆。將篩選得到的p ET28a-lysC和p ET28a-lysC1分別轉入大腸桿菌BL21,得到轉化子;將篩選得到的pDXW-8-lysC1和pDXW-8分別轉入乳糖發酵短桿菌A TCC13869,得到轉化子。大腸桿菌用CaCl2法轉化,乳糖發酵短桿菌用電轉化方法轉化[6];均用卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆。其中,p ET28a-lysC1中lysC1的序列由上海生工生物工程技術服務有限公司測定。

1.2.4 粗酶液制備 分別挑取大腸桿菌BL 21/p ET28a-lysC和BL21/p ET28a-lysC1在新鮮平板上的單菌落接種至LB液體培養基,在37℃和200 r/min過夜培養。按體積分數1%接種量轉接新的LB液體培養基,培養至A600為0.6,添加 IPTG(終濃度為1 mmol/L)誘導表達,繼續培養5 h,收集菌體,離心,棄上清。菌體用緩沖液(20 mmol/L Tris-Cl,500 mmol/L(NH4)2SO4,150 mmol/L NaCl)[9]重懸,洗滌,離心后再重懸于3倍菌體體積的緩沖液,用高壓細胞破碎儀破碎。在12 000 r/min離心30 m in,取上清,用同樣緩沖液進行透析后,超濾濃縮,即得粗酶液。粗酶液中蛋白采用Bradford法定量,以小牛血清蛋白為標準。

1.2.5 A K酶活測定 采用0.7 m L的反應體系,其中含有10 mmol/L M gSO4,10 mmol/L L-天冬氨酸,10 mmol/L A TP,0.6 mol/L羥胺和適量粗酶液。從加入酶液開始計時,在30℃反應1 h后,加入0.7 mL反應終止液(質量分數10%FeCl3·6H2O,體積分數 3.3%三氯乙酸,0.7 mol/L HCl),離心,取上清液在540 nm紫外波長下測吸光值(ε=600 L/(cm·mol))[9]。以加入酶液后立即加反應終止液為空白對照;以不外加底物天冬氨酸作為參照,監測透析是否完全。鑒定抗反饋抑制特性時,在反應體系中分別添加5 mmol/L L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸和L-賴氨酸。單位比酶活(U)定義為:1 mg酶蛋白在1 min內催化足量底物生成1μmol產物。

1.2.6 乳糖發酵短桿菌菌體量的測定 吸取0.1 m L的發酵液,加入5 mL蒸餾水稀釋,采用紫外分光光度計測定562 nm波長下的吸光度。

1.2.7 氨基酸含量測定 采用高效液相色譜系統(HPLC)自動柱前衍生化法測定。所用色譜柱為Agilent Eclip se-AAA柱。采用流動相組成為水相(1 L):4.52 g無水乙酸鈉,200μL三乙胺,5 m L四氫呋喃,p H 7.2;有機相(1 L):4.52 g無水乙酸鈉,400 m L甲醇,400 m L乙腈。色譜條件:柱溫40℃,流量1.0 mL/min,DAD檢測器。

2 結果與討論

2.1 lysC和lysC1的PCR擴增及其表達質粒的構建

以乳糖發酵短桿菌A TCC13869和L-異亮氨酸生產菌基因組為模板,用引物 F1/R1分別擴增出lysC和lysC1(1 266 bp)。以L-異亮氨酸生產菌基因組為模板,用引物 F2/R2擴增出lysC1。經瓊脂糖凝膠電泳檢測,在1 000～1 500 bp間有目的條帶。將從大腸桿菌JM 109陽性克隆提出的質粒p ET28a-lysC、p ET28a-lysC1、pDXW-8-lysC1 用EcoRⅠ酶切驗證,通過瓊脂糖凝膠電泳驗證了質粒大小,通過測序得到基因序列。

2.2 lysC1的突變位點

共隨機選取6個大腸桿菌JM 109陽性克隆,從中提取質粒進行測序。測得的lysC1序列一致。通過Blast比對,發現lysC1與谷氨酸棒桿菌A TCC13032lysC有22個堿基差異,導致2個有義氨基酸突變位點A la 279 Thr和 Ser 317 A la。此外,lysC基因的1186G和1187C在lysC1中缺失。

2.3 lysC和lysC1在 E.coli BL21中的誘導表達

以p ET28a為載體,lysC和lysC1均可以在大腸桿菌BL21中進行誘導表達。如圖1所示,在相對分子質量44 300～66 400間可見清晰表達條帶,野生型A K與文獻報道一致[10],lysC1表達的A K-1與預測蛋白質大小吻合。加上載體N端和C端的His-Tag,A K大小為49 200;加上載體N端的His-Tag,A K-1大小為46 000。A K的表達量明顯高于A K-1,約是4倍關系。這可能因為lysC1的高拷貝數表達造成了胞內中間代謝產物的過量積累,影響細胞生長,進而影響了lysC1的表達[11]。

圖1 lysC和lysC1在大腸桿菌BL21中的誘導表達Fig.1 Expression of lysC and lysC1 in E.coli BL21 after IPTG induction

2.4 野生型AK和突變型AK-1的酶活比較

無抑制劑存在的情況下,測得的突變型A K-1酶活低于野生型A K(表1);但由于A K-1在大腸桿菌BL21中的誘導表達量約為A K的1/4,所以以粗酶液總蛋白質定量測得的表觀比酶活(umol/m in·mg總蛋白質)并不能說明A K-1活性低于A K。

在5 mmo l/L抑制劑存在時,A K輕度受賴氨酸抑制,幾乎不受蘇氨酸抑制,但受賴氨酸和蘇氨酸協同反饋抑制;A K-1受賴氨酸抑制程度較野生型輕,不受蘇氨酸抑制,33%酶活受賴氨酸、蘇氨酸協同反饋抑制。

表1 AK和AK-1的比酶活Tab.1 Specific activities of AK and AK-1

2.5 過表達lysC1對乳糖發酵短桿菌L-賴氨酸積累的影響

以大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭質粒pDXW-8為載體,在乳糖發酵短桿菌A TCC13869中過表達lysC1,通過發酵實驗研究其對菌株產酸的影響。

圖2 乳糖發酵短桿菌搖瓶發酵90 h對產酸影響Fig.2 90 h flask fermentation of B.lacto fermentum strains

如圖2(a)所示,在搖瓶發酵過程中,重組菌與出發菌株以及轉入空質粒的對照菌株生長情況相近,無明顯受阻現象,說明質粒的轉入及lysC1的過表達未對細胞造成大的負擔。發酵90 h后,用HPLC分析檢測發酵液中氨基酸的的種類與含量,發現L-賴氨酸積累量增長最大,達到7.4 g/L,分別是初始菌株A TCC13869和對照菌株A TCC13869/pDXW-8的37和49倍(圖2(b))。而發酵液中丙氨酸的含量明顯下降,從3.44 g/L降至1.95 g/L,說明lysC1的過表達有效地將中心碳代謝流引入了天冬氨酸族賴氨酸合成途徑。此重組菌在3 L發酵罐上,發酵72 h后,產L-賴氨酸可達40 g/L。

3 結 語

A K是整個天冬氨酸族氨基酸合成途徑上第一個關鍵酶,控制著用于合成天冬氨酸族氨基酸的碳流量,對于構建L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸高產菌株都具有重要意義。作者從一株乳糖發酵短桿菌L-異亮氨酸生產菌中克隆到一個編碼抗反饋抑制A K-1的lysC1基因,經測序比對,發現了新的與抗反饋抑制特性相關的突變位點。A K-1部分解除了L-蘇氨酸和L-賴氨酸的協同反饋抑制。而野生型A K受抑制情況與文獻報道一致:受蘇氨酸和賴氨酸協同反饋抑制,略受賴氨酸抑制,幾乎不受蘇氨酸抑制[13]。在乳糖發酵短桿菌A TCC13869中,利用中等拷貝數的大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭質粒pDXW-8過表達lysC1,L-賴氨酸產量可達40 g/L,而經多輪誘變得到的L-賴氨酸生產菌的最高產量僅為77～82 g/L[14]。這充分說明本研究發現的突變位點在L-賴氨酸合成中起著十分重要的作用。這些突變與已報道的與A K抗反饋抑制有關的突變位點Ser 381 Phe、Thr 311 Ile、Ser 301 Tyr/Phe 和 Thr 279 Pro[3,10,12]為構建具有遺傳背景明確的賴氨酸高產菌奠定了基礎。

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The Effect of LysC on L-Lysine Accumulation in
B revibacterium lactofermentum

DONG Xun-yan1, XU Da-qing1, LI Ye1, LI Jiang-hua2, WANG Xiao-yuan＊1
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi214122,China;2.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The genelysC1 encoding aspartate kinase A K-1 from aB revibacterium lactofermentumL-isoleucine producer was sequenced. Compared with thelysCfromCorynebacterium glutamicumA TCC13032,there were deletions of two nucleotides 1186G and1187C,leading to the pre-termination of translation.In addition,the following two mutated sites were also identified in lysC1:A la 279 Thr and Ser 317 A la.InEscherichia coliBL21,the expression level oflysC1 was lower than that oflysCfromB.lactofermentumA TCC13869.The A K-1 had a lower apparent value of specific activity than the wild type A K,but it was not sensitive to the feedback inhibition by the mixture of L-lysine and L-threonine.lysC1 was cloned into anE.coli-B revibacterium flavumshuttle expression vector pDXW-8 and transformed into wild typeB.lactofermentumA TCC13869.The recombinant strain A TCC13869/pDXW-8-lysC1 accumulated 7.5 g/L L-lysine after 90 h flask fermentation and 40 g/L after 72 h batch fermentation.These results would be very useful for constructing a genetically identified L-lysine producing strain with minimum genetic alterations.

book=593,ebook=289

Brevibacteriumlactofermentum, aspartate kinase, feedback inhibition,fermentation,L-lysine

Q 933

A

1673-1689(2011)04-0592-05

2010-03-25

國家863計劃項目(2007AA 02Z229和2007AA 02Z230)。

＊

王小元(1965-),男,山西垣曲人,教授,博士研究生導師,主要從事微生物學研究。Email:xiaoyuanwang@hotmail.com