反式脂肪酸 Trans C18∶1誘導內皮細胞凋亡的研究

邱 斌, 劉 蓉, 鄧澤元＊, 范亞葦, 李 靜, 胡蔣寧, 黎 玉

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,南昌大學,江西南昌 330047;2.南昌大學生命科學與食品工程學院,江西南昌 330047)

反式脂肪酸 Trans C18∶1誘導內皮細胞凋亡的研究

邱 斌1, 劉 蓉1, 鄧澤元＊1, 范亞葦1, 李 靜1, 胡蔣寧1, 黎 玉2

(1.食品科學與技術國家重點實驗室,南昌大學,江西南昌 330047;2.南昌大學生命科學與食品工程學院,江西南昌 330047)

通過檢測相關細胞凋亡指標,探討trans C18:1誘導內皮細胞的凋亡機制。采用體外細胞培養方法將不同濃度trans C18∶1與內皮細胞共同孵育后,通過吉姆薩染色,觀察內皮細胞形態變化;采用流式細胞儀檢測細胞的早期凋亡變化;通過試劑盒檢測觀察trans C18:1對凋亡酶Caspase活力的影響;最后考察Caspase抑制劑z-VAD-fm k,對trans C18∶1對內皮細胞存活率的影響。吉姆薩染色后,細胞呈典型的凋亡形態;流失細胞儀檢測內皮凋亡細胞的數量明顯增加;同時發現trans C18∶1引起內皮細胞的凋亡可能與Caspase-3酶激活有關,因為Caspase抑制劑又能提高trans C18∶1處理的內皮細胞存活率。

反式脂肪酸;trans C18∶1;內皮細胞;凋亡

反式脂肪酸(trans fatty acids,TFA)是油脂或含有油脂的食品中常見的一個組成成分[1]。由于TFA會加速動脈粥樣硬化,容易誘發心血管和老年癡呆等疾病。因此,食品中的 TFA的形成已成為當前國際上的研究熱點[2]。人攝入 TFA后,會引發系統炎癥和內皮功能改變,并進一步誘發心血管疾病的發生和發展,但具體的機制目前仍不清楚。

研究表明,內皮凋亡是血管損傷的重要作用機制,許多外界刺激均可誘導內皮凋亡,并進一步導致血管滲漏,炎癥和血液凝固[3]。作者已發現transC18∶1會造成內皮細胞損傷[4],現探討transC18∶1對內皮細胞凋亡的影響,希望為研究 TFA引起的動脈粥樣硬化的發生機制提供科學的數據。

1 材料與方法

1.1 材料

人臍靜脈內皮細胞株:南昌大學醫學院提供;trans C18∶1(反式-9-十八碳烯酸)、DM EM、胰蛋白酶M TT:Sigma公司產品;吉姆薩試劑盒:南京建成公司產品,酶標儀M K3:Thermo公司產品,Caspase-3試劑盒、Caspase廣譜抑制劑 z-VAD-fmk:Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒:南京凱基生物公司產品;流式細胞儀COUL TER EPICS XL:BECKM AN公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人臍靜脈內皮細胞的培養:取人臍靜脈血管內皮細胞細胞株復蘇,接種于50 m L培養瓶內,待生長鋪滿后,經2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代,置于37℃、體積分數5%的CO2培養箱培養。隔天換培養液,培養第3天分組。

1.2.2 吉姆薩染色 待細胞鋪滿90%以上時,棄去培養皿內原培養液,用PBS沖洗3次后加吉姆薩染色液Ⅰ染液3～5滴,使其迅速蓋滿皿底,大約1 min后滴加試劑Ⅱ緩沖液5～10滴,輕輕搖動平皿,使染液充分混合均勻,5～10 min后用超純水迅速沖去多余染液,晾干后在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.3 A nnexin V-FITC雙染法檢測細胞凋亡transC18∶1處理過的內皮細胞用不含EDTA的胰酶消化,然后用PBS洗滌細胞兩次(2 000 r/m in離心5 min)收集1-5×105細胞,加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞,加入5μL AnnexinV-FITC混勻后,再加入5μL Propidium Iodide混勻,室溫、避光、反應5～15 min,在1 h內進行流式細胞儀的觀察和檢測。

1.2.4 Caspase-3活性的檢測 按試劑盒說明操

作,胰酶消化收集trans C18∶1處理過的內皮細胞并重懸于 Lysis Buffer(裂解液)中,冰上孵育 10 min,離心并收集上清液(胞漿提取液),加入含DDT的Reaction Buffer,再加5μL蛋白酶底物多肽37℃孵育4 h,在酶標儀405 nm處檢測光密度值。結果以檢測的A值表示。

1.2.5 Caspase抑制劑對內皮細胞存活率的影響

將細胞以1×105/m L接種于96孔板中,每孔加入細胞懸液100μL,待細胞長到融合。分別設立空白對照組,trans C18∶1(200μmol/L)組,Caspase抑制劑 1.25、2.5、5μmol/L Caspase抑制劑組中都同時添加trans C18∶1(200μmol/L),10μmol/L Caspase抑制劑組不添加trans18∶1,每個濃度6個復孔。37℃、體積分數5%CO2孵箱內培養24或48 h后,去除培養液,每孔加入0.5 mg/m L的M TT溶液20μL,繼續培養4 h后,棄去上清液,每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO),震蕩使藍紫色結晶充分溶解,用酶標儀測定A490nm值。計算各濃度Caspase抑制劑對細胞存活率的影響。

1.3 統計分析

所有實驗數據用SPSS for window s軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 trans C18∶1誘導內皮細胞凋亡的形態學觀察

如圖1所示,經吉姆薩染料著色后的細胞核呈紫紅色,而細胞漿著色不明顯,呈淡紅色。對照組細胞輪廓清晰,呈多角形“鋪路石樣”排列;核居中,為圓形或橢圓形。經200μmol/L trans C18∶1作用24 h后,胞質明顯回縮,細胞間連接消失,胞體呈圓形;胞核濃縮深染,偏于一側,部分核已破裂,呈現出凋亡細胞典型的形態學特征。

圖1 吉姆薩染色顯示內皮細胞形態變化Fig.1 Morphological changes shown by Gimersa staining

2.2 Annexin V-FITC法檢測trans C18∶1誘導內皮細胞凋亡

在細胞凋亡早期,位于細胞膜內側的磷脂酞絲氨酸(PS)遷移至細胞膜外側。Annexin V是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白,與PS具有高度的結合力。因此,AnnexinV可以作為探針檢測暴露在細胞外側的PS。將AnnexinV標記上綠色熒光蛋白FITC,同時結合核酸染料 PI(活細胞未染)進行細胞雙染,可區分活細胞、凋亡及死亡細胞。圖2顯示,對照組出現少量凋亡細胞(圖 2(a));trans C18∶1組,早期凋亡率為16.73%(圖2(b)),比對照組有明顯增加。

圖2 trans C18∶1對內皮細胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of trans C18∶1 on apoptosis rate

2.3 trans C18∶1對Caspase-3活性的影響

Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶,在細胞凋亡中起著不可替代的作用[5]。如圖3所示,Caspase-3活性可被 trans C18∶1激活,trans C18∶1(200μmol/L)與對照組相比Caspase-3活力有顯著升高(p<0.001)。

圖3 trans C18∶1對內皮細胞Caspase-3活性的影響Fig.3 Effect of trans C18∶1 on the activity of Caspase-3

2.4 Caspase抑制劑對trans C18∶1處理的內皮細胞存活率的影響

Caspase抑制劑對trans C18∶1處理的內皮細胞存活率的影響結果見圖4。將Caspase抑制劑z-VAD-fm k加入培養基中,trans C18∶1作用24～48 h后,發現Caspase抑制劑預處理組的內皮細胞存活率比僅trans C18∶1處理組明顯升高(p<0.001),且與對照組和單獨添加Caspase抑制劑相比無統計學差異。

圖4 Caspase抑制劑對細胞存活率的影響Fig.4 Effect of Caspase inhibitor on cell viability

3 結 語

眾多研究表明[6-7],在細胞凋亡的過程中,Caspase家族在其信號轉導系統中起著非常重要的作用,其中Caspase-3(胱氨酸蛋白酶-3)為關鍵的信息分子[8]。正常情況下,胞質中Caspase-3(胱氨酸蛋白酶-3)以無活性、相對分子質量約為32 000的前Caspase-3的形式存在。當細胞凋亡過程被啟動,凋亡信號傳導至Caspases時,可引起各種Caspases的“瀑布式”層層激活的蛋白酶級聯切割的過程,不同的蛋白酶分別切割 Caspase-3酶原,從而激活Caspase-3,活化的Caspase-3進一步又切割不同的底物,導致蛋白酶級聯切割放大,最終引起細胞凋亡[9]。而在此蛋白酶級聯切割過程中,Caspase-3處于核心位置,發揮重要的作用,因此被稱為死亡蛋白酶。

作者發現,在反式脂肪酸誘導內皮凋亡的過程中,Caspase-3活性顯著升高,表明 Caspase-3參與了內皮細胞的凋亡。Caspase抑制劑可通過提高trans C18∶1處理的內皮細胞存活率抑制內皮的細胞凋亡。Michaela Artwohl發現硬脂酸通過激活Caspase誘導內皮細胞凋亡,并且 Caspase抑制劑可以完全抑制硬脂酸誘導的內皮細胞凋亡[10],其結果和作者的研究結果一致。Yumi Kondoh發現transC18:1能夠激活 Caspase-3且部分激活Caspase-8,-9,誘導人肝癌細胞株(Hep G2)凋亡[11],說明死亡受體通路和線粒體通路均部分參與了transC18∶1誘導的 Hep G2細胞凋亡過程。TFA通過什么通路引起血管內皮細胞的凋亡,需要進一步深入研究。

（References）：

[1]鄧澤元,周瀟奇,黃玉華,等.中國居民20年間食物脂肪酸攝入量調查分析[J].食品與生物技術學報,2008,27:7-19.

DENG Ze-yuan,ZHOU Xiao-qi,HUANG Yu-hua,et al.Investigation of dietary fatty acids intakes of Chinese people during twtenty years[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2008,27:7-19.(in Chinese)

[2]陳宜,張青齡,林叢,等.食品中反式脂肪酸的研究進展[J].食品科技,2009,16(5):25-28.

CHEN Yi,ZHANGQing-ling,L IN Cong,et al.Research progresson trans fatty acids in food[J].Cerealand food industry,2009,16(5):25-28.(in Chinese)

[3]Winn RK,Harlan JM.The role of endothelial cell apoptosis in in?ammatory and immune diseases[J].Thromb Haemost,2005,3:1815-24.

[4]邱斌,劉蓉,鄧澤元,等.反式C18:1對血管內皮細胞損傷的影響[J].營養學報,2010,32:328-335.

Q IU Bin,L IU Rong,DENG Ze-yuan,et al.Effects of trans C18∶1 on endothelial injury[J].Acta Nutrimenta Sinica,2010,32:328-335.(in Chinese)

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[7]Evan G,Littlewood T.A matter of life and cell death[J].Science,1998,281(5381):1317-1322.

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[11]Yumi Kondoh,Teruo Kawada,Reiko Urade.Activation of caspase 3 in Hep G2 cells by elaidic acid(t18∶1)[J].Biochimica et Biophysica Acta,2007,17(71):500-505.

Apoptosis of Human Umbilical Vein Endothelial Cells Induced by Trans C18∶1

QIU Bin1, LIU Rong1, DENG Ze-yuan＊1, FAN Ya-wei1,LI Jing1, HU Jiang-ning1, LI Yu2

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.School of Life Sciences and Food Engineering,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

The target of this study is to exoplore the apoptotic mechanism of endothelial cells through detecting relevanting apoptosis index.For this,EC were cultured with trans C18∶1 at different concentrations,then the morphological changes of endothelial cells were observed through giemsa staining.The apoptotic cells were detected by flow cytometry.The activity of caspase-3 was detected by spectrophotography after endothelial cells treated with trans C18∶1.The cell viability was measured by MTT after endothelial cells cultured with trans C18∶1 and caspase inhibitor for 24～48 h.Results:The number of apoptotic cells raised and endothelial cells displayed classical apoptotic morphology after endothelial cells cultured with trans C18∶1.The activity of caspase-3 ascended and the caspase inhibitor could protect endothelial cells from trans C18∶1.

trans fatty acids,trans C18∶1,endothelial cell,apoptosis

＊通信作者：鄧澤元(1963-),男,江西瑞金人,教授,博士研究生導師,主要從事脂肪酸研究。Email:dengzy28@yahoo.com.cn

R 151.41

A

1673-1689(2011)04-0588-04

2010-08-26

國家自然科學基金項目(30972482),江西省學術帶頭人計劃項目(2008DD00900),教育部博士點基金項目(20070403002),江西省自然科學基金項目(2008GQY0023)。

邱斌(1982-),男,山東肥城人,食品科學與工程博士研究生,主要從事食品營養學研究。Email:422083898@qq.com