白藜蘆醇對酪氨酸酶體外抑制活性的動力學研究

楊 陽, 魯 軍, 孫冰潔, 王 丹, 尹曉燕, 任迪峰＊

(1.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083;2.中國食品發酵工業研究院,北京 100027)

白藜蘆醇對酪氨酸酶體外抑制活性的動力學研究

楊 陽1, 魯 軍2, 孫冰潔1, 王 丹1, 尹曉燕1, 任迪峰＊1

(1.北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083;2.中國食品發酵工業研究院,北京 100027)

在30℃,p H 6.8的Na2HPO4-NaH2PO4的緩沖體系中,采用酶促動力學方法,研究了白藜蘆醇對酪氨酸酶單酚酶和二酚酶的抑制作用。結果表明,白藜蘆醇對酪氨酸酶、單酚酶和二酚酶均有抑制作用,對單酚酶抑制活性的IC50值(抑制率達到50%時的白藜蘆醇質量濃度)約為5.1 mg/m L,對二酚酶抑制活性的IC50值約為5.6 mg/m L。此外,白藜蘆醇可延長單酚酶的遲滯效應,8 mg/mL的白藜蘆醇能使遲滯時間從22 s延長至62 s,而對二酚酶則無此遲滯作用。Lineweaver-Burk圖分析表明,白藜蘆醇對酪氨酸酶的抑制作用為混合型抑制,對游離酶的抑制常數(KI)和對酶-底物絡合物的抑制常數(KIS)分別為3.4 mg/m L和35.98 mg/m L。

白藜蘆醇;酪氨酸酶;抑制活性;酶促動力學

酪氨酸酶(Tyrosinase)是由二價銅離子與酶蛋白結合的金屬酶,是生物體合成黑色素的關鍵酶[1,2],可催化含酚基化合物(如酪氨酸、酚類化合物等)氧化成多巴醌,經一系列中間反應后形成黑色素,而黑色素的合成、分布與哺乳動物皮膚、毛發的色素沉積直接相關[3,4],與果蔬褐變也有著有重要的關系[5]。因此,通過篩選合成酪氨酸酶抑制劑,抑制酪氨酸酶的活性來控制黑色素的合成,已成為防止果蔬褐變、色斑治療及美白化妝品研制的一種重要途徑。

由于天然植物資源來源廣泛、安全性高,從植物來源中分離提取正成為開發酪氨酸酶抑制劑的熱點。國內外已有研究從多種植物中分離出效果顯著的黃酮多酚類酪氨酸酶抑制劑,如山奈酚[6,7]、檞皮素[8,9]、花蜜粉提取物等[10]。白藜蘆醇是一種二苯乙烯類化合物,在自然界分布廣泛,其中以虎杖、葡萄、花生等植物中含量居多。作為一種天然產物,白藜蘆醇對人體有著重要的生理和醫療保健功能,如抗癌、抗腫瘤、調節血脂代謝、保護心血管、抗氧化、消炎、保肝、雌激素調節等作用[11]。然而,目前仍未見有關其酪氨酸酶抑制活性的研究報告。作者對白藜蘆醇的酪氨酸酶抑制活性進行測定,以白藜蘆醇為效應物,研究其對酪氨酸酶催化活性的影響,從而為推進白藜蘆醇在功能性食品和祛斑、美白化妝品等醫藥制劑上的進一步應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

蘑菇酪氨酸酶(比活力4276 U/mg)、3,4-二羥基苯氨酸(L-DOPA)、L-酪氨酸:購自美國 Sigma化學公司;白藜蘆醇:購自中國標準物質網;二甲基亞砜(DM SO)、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉:購自北京藍弋化學試劑公司;蒸餾水:為去離子重蒸水。

752型紫外可見分光光度計:上海美譜達儀器有限公司產品;恒溫箱:北京蘇瑞試驗設備有限公司產品。

1.2 單酚酶活力的測定

酪氨酸酶催化L-酪氨酸、L-DOPA的產物多巴色素在475 nm處有最大吸收。用酪氨酸酶多巴速度氧化法,通過測定酶催化反應體系的A475nm隨時間的增長直線,從直線斜率即可求得酶活力。以1.5 mmol/L L-酪氨酸為底物。先將 0.9 m L 5 mmol/L L-酪氨酸溶于磷酸鹽緩沖溶液(p H 6.8)于比色杯中,加入 1.92 m L磷酸鹽緩沖溶液(p H6.8),在30℃恒溫箱中恒溫10 min,然后加入0.12 m L不同濃度的白藜蘆醇溶液(溶于DM SO)和0.06 m L 0.232 g/L酪氨酸酶水溶液,混勻,立即測定A475nm。每個樣品做3個平行樣,以沒有加酪氨酸酶的為空白樣。在此測活體系中,酶的終質量濃度為4.64 mg/L。

1.3 二酚酶活力的測定

以1.5 mmol/L L-DOPA為底物。先將0.9 m L 5 mmo l/L L-DOPA溶于磷酸鹽緩沖溶液(p H6.8)于比色杯中,加入1.86 mL磷酸鹽緩沖溶液(p H6.8),在30℃恒溫箱中恒溫10 min,然后加入0.12 m L不同質量濃度的白藜蘆醇溶液(溶于DM SO)和0.12 m L 0.232 g/L酪氨酸酶水溶液,混勻,立即測定A475。每個樣品做3個平行樣,以沒有加酪氨酸酶的為空白樣。在此測活體系中,酶的終質量濃度為9.28 mg/L。

式中:A1是含有底物、酪氨酸酶、白藜蘆醇的測活體系反應4 min時的吸光度值;A2是含有底物、酪氨酸酶,但不含白藜蘆醇的測活體系反應4 m in時的吸光度值;A0是含有底物,但不含酪氨酸酶、白藜蘆醇的測活體系反應4 min時的吸光度值。

1.4 酶促動力學分析

研究白藜蘆醇對酪氨酸酶的抑制作用類型,以L-DOPA為底物,在測活體系中,固定酶的質量濃度,通過改變底物L-DOPA的濃度,測定不同質量濃度白藜蘆醇對酪氨酸酶活力的影響,并采用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法進行酶促動力學分析。在4 m L的比色皿中,加入濃度分別為0.25、0.5、1、2 mmol/L的L-DOPA溶于磷酸鹽緩沖溶液(p H 6.8)0.9 m L,再加1.86 m L的磷酸緩沖液,在30℃恒溫箱中恒溫10 min,白藜蘆醇(溶于DMSO)以不同濃度(0、2、4、6 和 8 mg/mL)各取 0.12 m L放入比色皿中,最后加入酪氨酸酶水溶液,立即混勻,連續記錄6 min內的吸光度值。以反應速度倒數(1/v)對底物濃度的倒數(1/Cs)作圖,得到Lineweaver-Burk圖,對白藜蘆醇的抑制類型進行分析,比較酶催化反應動力學參數,包括米氏常數(Km)、最大反應速率(Vm)。并以Lineweaver-Burk圖中各直線斜率和縱軸截距分別對白藜蘆醇濃度二次作圖,進而求得白藜蘆醇對游離酶和對酶-底物絡合物的抑制常數。

2 結果與討論

2.1 白藜蘆醇對酪氨酸酶單酚酶活力的影響

圖1為不同質量濃度的白藜蘆醇對酪氨酸酶單酚酶抑制作用的進程曲線,反應剛開始時產物生成緩慢,此為遲滯期,到一定時間后,反應速度直線上升達到恒定的速率,到達穩定態,穩定態即為直線部分,遲滯時間為直線部分交于橫軸的截距。

圖1 白藜蘆醇對酪氨酸酶單酚酶抑制作用的進程曲線Fig.1 Time-course curve for inhibitory effect of resveratrol on the monophenolase activity of tyrosinase

圖1結果表明,白藜蘆醇對酪氨酸酶的單酚酶活性有抑制作用,能延長單酚酶反應的遲滯時間,并隨白藜蘆醇濃度的增大,遲滯時間延長,穩態酶活力下降。遲滯效應是酪氨酸酶催化氧化酪氨酸的典型特征。有研究表明,遲滯時間的長短取決于反應溶液中酶和底物的濃度,另外,加入過度金屬離子或者二酚可縮短甚至消除遲滯效應[12]。

圖2 白藜蘆醇對酪氨酸酶單酚酶相對酶活力的影響Fig.2 Effects of resveratrol on the relative monophenolase activity of tyrosinase

圖2為不同質量濃度的白藜蘆醇對穩態酶活力和遲滯時間的影響,結果表明,隨著白藜蘆醇質量濃度的增大,遲滯時間明顯延長:未加白藜蘆醇時,遲滯時間為22 s;當加入8 mg/m L的白藜蘆醇時,遲滯時間延長至62 s,遲滯時間幾乎增加至原來的3倍,同時穩態酶活力下降了67.4%,可以看出,白藜蘆醇具有較大的酪氨酸酶單酚酶抑制活性,IC50值約為5.1 mg/m L。

2.2 白藜蘆醇對酪氨酸酶二酚酶活力的影響

圖3為不同質量濃度的白藜蘆醇對酪氨酸酶單酚酶抑制作用的進程曲線。結果表明,酪氨酸酶催化氧化L-DOPA的進程曲線是通過原點的直線,不存在遲滯效應,隨著加入的白藜蘆醇質量濃度的增大,直線的斜率下降,即表明二酚酶催化氧化的速率降低,酶活力下降,白藜蘆醇對酪氨酸酶二酚酶活性有抑制作用。

圖3 白藜蘆醇對酪氨酸酶二酚酶抑制作用的進程曲線Fig.3 Time-course curve for inhibitory effect of resveratrol on the disphenolase activity of tyrosinase

圖4為不同質量濃度的白藜蘆醇對酪氨酸酶二酚酶抑制效應的進程曲線,反應進程是通過原點的直線,二酚酶催化L-DOPA不存在遲滯效應,結果表明,隨著白藜蘆醇質量濃度的增大,相對酶活力下降,當加入8 m g/m L的白藜蘆醇時,酶活力下降了66.1%,可以看出,白藜蘆醇具有較大的酪氨酸酶二酚酶抑制活性,IC50值約為5.6 mg/m L。

圖4 白藜蘆醇對酪氨酸酶二酚酶相對酶活力的影響Fig.4 Effects of resveratrol on the relative diphenolase activity of tyrosinase

2.3 白藜蘆醇對酪氨酸酶的抑制類型

根據Lineweaver-Burk雙倒數作圖法判斷抑制類型,通過作圖得到一組相交于第二象限的直線,說明白藜蘆醇作為抑制劑對酪氨酸酶的抑制類型為混合型抑制,即加入的白藜蘆醇不僅可以影響酶促反應的最大反應速度(Vm),還可以影響米氏常數(Km):隨著白藜蘆醇濃度的增大,Km值增大Vm值下降,說明白藜蘆醇既能與游離酶(E)結合,又能與酶-底物絡合物(ES)結合。

二次作圖,分別以各直線斜率對白藜蘆醇質量濃度作圖及以各直線與縱軸截距對白藜蘆醇質量濃度作圖得到回歸直線[13],分別求得白藜蘆醇對游離酶的抑制常數(KI)為3.35 mg/mL,對酶-底物絡合物的抑制常數(KIS)為35.98 mg/m L。

3 結 語

白藜蘆醇對酪氨酸酶單酚酶和二酚酶均有抑制作用,對單酚酶的抑制作用主要表現為酶催化反應遲滯時間的延長,8.0 mg/mL的白藜蘆醇可使單酚酶的遲滯時間幾乎延長至原來的3倍,同時穩態酶活性也下降了80%;對酪氨酸酶的抑制作用表現為混合型抑制,對游離酶的抑制常數(KI)為3.35 mg/mL,對酶-底物絡合物的抑制常數(KIS)為35.98 mg/m L。白藜蘆醇對抑制單酚酶、二酚酶活性的IC50值分別約為5.1 mg/mL和5.6 mg/mL。

白藜蘆醇對酪氨酸酶的抑制作用為白藜蘆醇作為酪氨酸酶抑制劑提夠了理論支持,為新型酪氨酸酶抑制劑的開發應用提供了新途徑。此外,白藜蘆醇作為天然產物,來源豐富、安全性高。它不但可用于色素增加性皮膚病(黃褐斑、雀斑等)的臨床治療,而且可用于化妝品使膚色增白,還有可能應用于農業生產上作為一種害蟲調控劑和食品工業上作為食品添加劑[14],成為預防果蔬褐變和治療各種色素病的良好制劑[15],具有廣泛的應用價值和廣闊的市場前景。

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Inhibitory Kinetics Study of Resveratrol on Tyrosinase Activity in Vitro

YANG Yang1, LU Jun2, SUN Bing-jie1, WANGDan1,YIN Xiao-yan1, REN Di-feng＊1

(1.College of Biological Sciences and Bio technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027,China)

The inhibitory effect of resveratrol on the activity of monophenolase and diphenolase existing in tyrosinase was investigated by the enzymatic kinetic method at 30℃in a Na2HPO4-NaH2PO4buffer system(p H6.8).The results indicated that resveratrol could inhibit both the monophenolase and diphenolase activities of tyrosinase,and the IC50values (resveratrol concentration corresponding to 50%inhibitory rate)w ere 5.1 mg/m L and 5.6 mg/m L,respectively.Furthermore,resveratrol could extent the lag time of monophenolase for oxidation of L-tyrosine,of which 8 mg/m L of resveratrol prolonged the lag time from 22 s to 62 s,while no such effect was observed on diphenolase.According to the Lineweaver-Burk plot,resveratrol was found to be a mixed inhibitor for the oxidation of L-DOPA,and the equilibrium constants for binding with free enzyme KIand with enzyme-substrate comp lex KISwere 3.4 mg/m L and 35.98 mg/m L,respectively.

resveratrol,tyrosinase,inhibitory activity,enzymatic kinetics

＊

任迪峰(1973-),女,湖南岳陽人,工學博士,副教授,主要從事食品生物技術與營養研究。Email:rendifeng@163.com

Q 55

A

1673-1689(2011)04-0632-04

2010-09-01

中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(TD2010-3、BL YX200935)、第38批留學回國人員科研啟動基金。