矛尾復蝦虎魚潰瘍病病原創傷弧菌的鑒定

畢可然, 張曉君, 梁利國, 閻斌倫

(淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點實驗室, 江蘇 連云港 222005)

矛尾復蝦虎魚潰瘍病病原創傷弧菌的鑒定

畢可然, 張曉君, 梁利國, 閻斌倫

(淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點實驗室, 江蘇 連云港 222005)

2009年8月江蘇連云港贛榆縣多家蝦蟹養殖塘混養的矛尾復蝦虎魚(Synechogobius hasta)大量死亡, 從病魚深層潰爛組織及肝臟中分離出大量優勢生長的細菌, 人工感染試驗證明分離菌對蝦虎魚的半數致死量(LD50)為1.63×106cfu/g。對分離菌進行了形態特征、理化特性和分子生物學等方面的分析。一方面, 分離菌株16S rRNA和gyrB基因序列的BLAST搜索及最大簡約法分析均表明其與創傷弧菌(Vibrio vulnificus)親緣關系最近; 另一方面, 分離菌革蘭氏陰性, 氧化酶陽性, 葡萄糖發酵型。因此, 引起江蘇連云港贛榆縣矛尾復蝦虎魚潰瘍病病原菌是弧菌屬的創傷弧菌。

矛尾復蝦虎魚(Synechogobius hasta); 創傷弧菌(Vibrio vulnificus); 16S rRNA基因;gyrB基因

矛尾復蝦虎魚(Synechogobius hasta)隸屬鱸形目(Perciformes)蝦虎魚科(Gobiidae)。俗稱海鯰魚、沙光魚、扔巴魚, 是暖溫性近海中小型底層魚類,主要產于中國渤海、黃海、東海、臺灣海峽及沿海咸淡水水域[1], 是最近幾年在中國華北和華中大規模養殖的經濟魚類[2]。該魚肉質細微, 粗蛋白質、脂類、能源、磷和氨基酸等表觀消化率高[3], 深受消費者青睞。但隨著養殖規模的逐年擴大、養殖密度的日益提高, 在2009年8～9月, 江蘇連云港贛榆縣多家蝦蟹養殖池塘內的矛尾復蝦虎魚發生病害,造成了巨大的經濟損失。因此, 病害已成為制約矛尾復蝦虎魚健康養殖發展的關鍵因素之一。為了明確矛尾復蝦虎魚暴發性死亡原因, 本研究自發病蝦虎魚潰爛肌肉組織、肝臟中分離到菌落特征一致的優勢生長細菌, 采用細菌常規生化鑒定方法和分子生物學分析方法對發病矛尾復蝦虎魚進行了致病菌的鑒定, 旨在為科學防治矛尾復蝦虎魚疾病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 病魚檢驗及細菌分離

2009年 8月, 江蘇連云港贛榆縣蝦蟹養殖塘混養矛尾復蝦虎魚發生嚴重疾病, 其癥狀為頭部及體表出血, 部分病魚肌肉潰爛, 嚴重的露出骨骼; 剖檢可見病魚肝臟出血、腫脹, 腸壁發紅, 個別病魚肝臟糜爛。隨機取體表出血及潰爛嚴重的瀕死病魚10尾經 75%酒精棉球擦拭消毒并刮去表層, 以該深層潰爛組織、肝胰臟為樣品, 劃線接種于普通營養瓊脂培養基, 28℃培養24 h檢查, 取分離菌移接于普通營養瓊脂斜面(28℃培養24 h)做純培養供檢驗用, 菌株編號： S0908-2。

1.2 致病性試驗

從連云港市贛榆縣一家養殖池塘取規格一致、健康無病的矛尾復蝦虎魚 100尾。在實驗室水族箱系統內暫養2周后試驗用。取平均初始體質量28 g左右的矛尾復蝦虎魚 40尾, 隨機分為 5組, 每組 8尾, 置于5個室內流水容積為80 L長方形玻璃纖維鋼水族箱中。供試菌株S0908-2接種于普通營養肉湯,28℃過夜培養, 供試菌液調至 2.1×108、2.1×107、2.1×106、2.1×105cfu/mL, 共 4個稀釋度, 分別對 4組健康矛尾復蝦虎魚腹腔注射, 每尾 0.1 mL, 對照組接種同劑量無菌營養肉湯。接種后水族箱水溫(27±2)℃, 連續充氣, 每天換水, 定時觀察記錄 2周,計算半數致死量(LD50)。

1.3 形態觀察及理化特性分析

對供試菌株 S0908-2涂片經革蘭氏染色后鏡檢其形態。取純培養菌, 分別接種于細菌理化特性鑒定用培養基中, 按常規進行氧化酶、接觸酶、糖(醇及苷)類代謝、H2S、吲哚、MR、V-P試驗、硝酸鹽還原、OF試驗和枸櫞酸鹽利用等較系統的理化特性測定, 主要參照文獻[4]及文獻[5]進行。培養基及細菌微量生化反應管等購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 16S rRNA和gyrB基因序列測定及系統發生分析

取純培養供試菌液接種于含鹽1%的LB肉湯中28℃培養16 h, 按小量細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海賽百盛基因技術有限公司)所述方法提取基因組DNA保存于-20℃冰箱供PCR使用。提取的基因組分別利用細菌 16S rRNA 基因通用引物對 27F：5'-AGA GTT TGA TC(C/A) TGG CTC AG-3'; 1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'[6]和gyrB基因PCR通用引物對UP1： 5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CAY GCN GGN GGN AAR TTY GA-3';UP2r： 5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CCR TCN ACR TCN GCR TCN GTCAT-3'[7]進行 PCR擴增。每對PCR反應體系為 20 μL： 無菌蒸餾水14.4 μL,10×PCR 緩沖液 2 μL, 1.5 mmol/L MgCl21.6 μL,4×dNTP 混合物 0.4 μL, 10 pmol/L 引物各 0.2 μL,2.5U/μL 的 Taq DNA 聚合酶 0.2 μL, Genomic DNA 1μL。PCR反應條件為： 95℃預變性5 min; 94℃變性1 min、55℃(27F/1492R)和 57℃(UP1/ UP2r)退火 1 min、72℃延伸2 min, 30個循環; 最后72℃延伸8 min。PCR擴增產物送上海生物工程技術公司測序部測序。

測序后的序列均使用 DNASTAR軟件包(Madison, Wisconsin)中SeqMan II軟件進行校對和拼接。拼接后的序列分別上傳到NCBI的BLAST檢索系統(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)進行同源性分析, 同時 GenBank數據庫中同源物種序列被下載利用 Clustal X1.8[8]軟件進行多序列比對, 比對后序列利用 PAUP4.0軟件包[9]中最大簡約法(maximum parsimony, MP)構建系統發生樹。

1.5 菌種分類位置確定

根據細菌形態、培養及理化特性測定的結果, 主要依據文獻[10], 文獻[11]及有關資料, 并結合細菌16S rRNA和gyrB基因系統發生分析結果, 進行分離菌的種屬分類位置判定。

2 結果

2.1 分離菌的致病性

人工感染實驗結果表明, 菌株 S0908-2對矛尾復蝦虎魚有較強的毒力, 半數致死量(LD50)為1.63×106cfu/g。取感染死亡蝦虎魚肝臟組織做細菌分離、培養和檢驗實驗, 結果不僅分離到大量優勢生長的菌株, 同時該分離菌的形態、生長特性同菌株S0908-2相似。表明分離菌S0908-2是導致2009年8月連云港贛榆縣養殖矛尾復蝦虎魚潰瘍并大量死亡的病原菌。

2.2 菌體形態及理化特征

供試菌株 S0908-2革蘭氏染色為陰性短桿菌,大小在(0.5～0.8) μm×(0.8～3.2) μm; 在普通營養瓊脂培養基平板上, 菌落邊緣出現鋸齒狀, 單個菌落光滑圓形, 隆起, 半透明, 乳白色, 培養24 h檢查直徑多在 l mm左右。常規生理生化試驗表明, 菌株S0908-2氧化酶和接觸酶陽性, 葡萄糖發酵型, 符合弧菌屬共有特征; 該菌精氨酸雙水解酶陰性, 利用葡萄糖產酸, 不利用肌醇、蔗糖、阿拉伯糖, 在無NaC1胨水中不生長, 1%、3%和6%NaC1胨水中能生長, 這些指標與創傷弧菌(Vibrio vulnificus)的生理生化特性均一致, 因此可將其初步鑒定為創傷弧菌,其生理生化特性見表1。

2.3 16S rRNA 和gyrB基因序列與系統發育學

S0908-2菌株16S rRNA和gyrB基因序列全長依次是1450bp和1194bp。上傳NCBI經BLAST同源性檢索結果均顯示與創傷弧菌16S rRNA、gyrB基因序列同源性最高, 均達到 99%?；诒葘Y果從GenBank數據庫分別下載已有弧菌屬菌株16S rRNA和gyrB基因同源序列, 下載的序列經 Clustal X1.8軟件比對分析后, 可構建最大簡約樹的堿基分別是1311bp (16S rRNA )和1050bp (gyrB)。兩基因系統發生分析結果均支持分離菌株 S0908-2是創傷弧菌的一員, 系統發生樹見圖1和圖2。

3 討論

在細菌鑒定和系統分類學研究中, 核糖體小亞基rRNA(16S rRNA)基因素有“分子化石”之稱, 幾乎可以對所有的細菌進行屬水平上的鑒定[12]。然而,由于 16S rRNA 分子高度保守, 對序列相似性極高的近緣種無法做進一步區分, 常不能反映關系較近的物種間關系; 另16S rRNA基因序列的高級結構對一級結構進化有束縛, 序列比對時可能還必須考慮二級結構, 否則會影響系統發育關系的準確性[13]。因此, 在最近研究中, 一些研究者嘗試用其他保守的蛋白編碼基因進行細菌系統發育分析, 與16S rRNA基因序列分析得到的結果相互補充和驗證。gyrB基因是單拷貝的持家基因, 普遍存在于各種細菌中,編碼DNA 促旋酶(DNA gyrase)的B亞單位, 序列長度約1.2～1.4 kb, 平均堿基替換率為每100萬年變化0.7%～0.8%, 比16S rDNA 的每5000萬年變化1%的速率要快[14], 而且不發生水平轉移, 因此特別適用于菌種間的區別和鑒定。在弧菌科致病菌區分中, 基于gyrB基因序列分析, 16S rRNA基因不能區分的副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)、霍亂弧菌(V. cholera)等被明顯分為不同的致病菌[15], 在牡蠣創傷弧菌鑒定中, Kumar等[16]使用創傷弧菌gyrB基因特異引物gyr-vv1 和gyr-vv2實現了30 CFU/g創傷弧菌的低濃度檢測。本研究采用了細菌16S rRNA和gyrB基因通用引物對創傷弧菌疑似株序列進行了PCR擴增、測序和系統發生分析, 兩基因分析結果均支持S0908-2菌株隸屬于創傷弧菌, 同時在gyrB基因系統發生樹中, S0908-2菌株與已報道創傷弧菌菌株聚類節點的自引導值是99%(圖2), 而16S rRNA基因聚類節點自引導值僅為69%(圖1)。此外, 生理生化特性(在無鹽條件下不生長; 氧化酶、接觸酶陽性, 葡萄糖發酵型; 能利用D-半乳糖、乳糖、纖維二糖; 不利用蔗糖、阿拉伯糖; 精氨酸雙水解酶陰性等)也判定分離于發病矛尾復蝦虎魚的致病菌株為創傷弧菌。因此, 結合菌株生理生化特性和多基因分子鑒定, 確診連云港贛榆縣多家蝦蟹養殖塘混養的矛尾復蝦虎魚暴發的疫病為創傷弧菌病。

表1 菌株S0908-2與創傷弧菌的表型特征比較Tab. 1 Physiological and biochemical characteristics of S0908-2 and V. vulnificus

圖1 基于S0908-2分離菌株16S rDNA序列構建的最大簡約樹Fig. 1 Maximum parsimony tree based on 16SrDNA sequence of the isolated S0908-2 strain

圖2 基于S0908-2分離菌株gyrB基因序列構建的最大簡約樹Fig. 2 Maximum parsimony tree based on gyrB gene sequence of the isolated S0908-2 strain

創傷弧菌是一種有莢膜的革蘭氏陰性嗜鹽弧菌,廣泛分布于河口和沿海水域水產品中, 不僅是海水養殖經濟動物弧菌病的主要致病菌之一, 可引起日本鰻鱺(Anguilla japonica)[17]、歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)[18]、羅非魚(Tilapia)[19]、石斑魚(Epinephelus)[20]、石鰈(Kareius bicoloratus)[21]、軍曹魚(Rachycentron canadum)[22]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[23]、黃姑魚(Nibea albiflora)[24]等暴發流行性病而大規模死亡; 同時還是引起人獸共患病的重要病原菌[25], 既能通過生食含菌的海產品引起原發性敗血癥和壞死性胃腸炎、腦膜炎、肺炎、角膜炎等疾病, 也能通過海水介質致使皮膚創口組織壞死引起嚴重的創口感染。本研究中S0908-2菌株對矛尾復蝦虎魚表現出較強的致病性, 人工感染后較短時間內發生死亡, 死亡個體頭部及體表出血, 肌肉潰爛, 腸壁發紅, 肝臟出血糜爛。對養殖和食用帶來很大危害。因此, 矛尾復蝦虎魚創傷弧菌病的研究將成為海水養殖業的重要課題之一。

綜上所述, 作者初步判定江蘇省連云港市特產經濟動物-矛尾復蝦虎魚潰瘍病病原是弧菌屬的創傷弧菌。但有關此創傷弧菌對矛尾復蝦虎魚的致病機理, 在中國所有野生和養殖矛尾復蝦虎魚中的分布有待進一步研究。

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Identification ofVibrio vulnificusfromSynechogobius hastawith canker disease

BI Ke-ran, ZHANG Xiao-jun, LIANG Li-guo, YAN Bin-lun
(Key Laboratory of Oceanic Biotechnology of Jiangsu, Huaihai Institute of Technology, Lian Yungang 222005,China)

Nov., 2, 2010

Synechogobius hasta; Vibrio vulnificus;16S rRNA gene;gyrBgene

In August 2009, mass mortality ofSynechogobius hastawas observed in the shrimp and crabs pond of Ganyu county, Lianyungang city, Jiangsu province. Some pathogenic organisms were isolated from the liver and deep ulceration of the diseasedS. hasta. The dominant bacterial strain was Gram-negative, oxidase positive, and fermented glucose to produce acids. In addition, 16S rRNA andgyrBgenes analysis showed that isolation was closely related toVibrio vulnificusthan other bacterium. The sequences similarity coefficients were 0.99, on the other hand, and the phylogenetic trees strongly supported isolation were grouped with some reportedV. vulnificus.Moreover, the LD50of the bacteria toS. hastawas 1.63×106cfu/g. We concluded thatV.vulnificuswas an important pathogenic bacteria causing canker disease inS. hastain Ganyu county, Lianyungang city, Jiangsu province.

S968

A

1000-3096(2011)07-0020-06

2010-11-02;

2011-04-18

江蘇省水產三項工程資助項目(PJ2010-58); 江蘇省自然科學基金資助項目(BK2009163); 江蘇省生物多樣性與生物技術重點實驗室開放基金資助項目(164070302104)

畢可然(1978-), 女, 內蒙古人, 講師, 博士, 主要從事水產動物病原鑒定和檢測研究, 電話： 15896101504, E-mail：bikeran@126.com; 張曉君, 通信作者, 教授, E-mail：zxj9307@163.com

譚雪靜)