高產腈水解酶Alcaligenes faecalis UL44菌株的誘變篩選

徐建明，柳志強，徐建妙，張金峰，鄭裕國

(浙江工業大學生物工程研究所，浙江杭州310014)

草甘膦是一種安全的滅生性除草劑，具有廣譜、低毒和無殘留的特點。隨著轉基因抗草甘膦作物的發展，全球草甘膦的使用面積正以每年20%的速度遞增，成為具有典型代表性的農藥產品［1］。我國草甘膦的生產工藝主要分為甘氨酸法［2-3］和二乙醇胺-亞氨基二乙酸(Iminodiacetic acid，簡稱IDA)法［4］。目前國際的主流路線則是IDA法，而亞氨基二乙酸的生產都是采用化學法生產，生產過程采用劇毒的氫氰酸，污染嚴重、成本高［5］，利用微生物酶法生產亞氨基二乙酸具有反應條件溫和，環境污染少等特點［6］，但其面臨的主要問題是腈水解酶酶活不高，需通過菌種改良的方法得到具有較高腈水解酶酶活的菌株。亞氨基二乙酸為白色結晶粉末或白色斜方晶體，無毒，是一種重要的化工中間體。其用途廣泛，主要應用于合成農藥草甘膦。IDA具有很強的絡合能力，能和多種金屬離子絡合而形成螯合物，同時分子中又含有亞氨基和羧基，化學性質活潑應用廣泛［7-8］。離子注入誘變微生物的應用是近些年來發展較快的一種輻射誘變技術［9］，它和其他常規的輻射誘變及化學誘變有著明顯的差異，其他輻射誘變僅僅是利用能量交換，化學誘變是利用分子基團的交換，而離子注入誘變集物理輻射誘變和化學誘變于一體，因此，離子注入誘變打破了傳統誘變方法中多次誘變導致的負突變和抗性飽和。本研究對本實驗室從土壤中篩選得到的腈水解酶產生菌Alcaligenes faecalis ZJB09133進行了紫外線和低能離子束誘變，最終選育得到4株可穩定遺傳的正突變菌株，酶活最高的菌株UL44較原始菌株在腈水解酶酶活上提高了124.5%。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株原始菌株為Alcaligenes faecalis ZJB09133，由本實驗室從土壤中篩選得到。

1.1.2 培養基及培養條件①斜面培養基(g/L)：酵母膏5，NaCl 10，蛋白胨10，瓊脂20，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min，置于30℃，培養24 h;②誘變培養基(g/L)：酵母膏5，NaCl 10，蛋白胨10，瓊脂20，LiCl 5，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min，置于30℃，培養48 h;③種子培養基(g/L)：醋酸銨7，甘露醇2.5，NaCl 1，酵母膏4，K2HPO45，MgSO40.2，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min，正丁腈0.3%(誘導劑，在接種時加入)，溫度為30℃，培養24 h;④發酵培養基(g/L)：醋酸銨7，甘露醇2.5，NaCl 1，酵母膏4，K2HPO45，MgSO40.2，pH 7.0，1×105Pa滅菌30 min，正丁腈0.4%(誘導劑，在接種時加入)，溫度為30℃，培養38 h。

1.1.3 主要試劑和設備亞氨基二乙腈，亞氨基二乙酸，Alfa Aesar購得;酵母膏、蛋白胨、醋酸銨、磷酸氫二鉀等均為市售分析純;液相色譜儀LC-10AS，日本島津;往復式水浴搖床ZHWY-110X30，上海智城分析儀器制造有限公司;IBBe-Device等離子注入儀，中國科學院等離子體物理研究所。

1.2 方法

1.2.1 紫外-氯化鋰復合誘變誘變處理時先打開紫外燈，預熱20 min，以穩定波長。吸取1 mL對數生長期的種子液，加入到裝有9 mL無菌水的試管中，梯度稀釋至一定濃度。吸取0.1 mL菌懸液均勻地涂布在LB培養基上，將培養皿放入紫外誘變箱中，打開培養皿蓋，采用功率15 W紫外燈，照射距離30 cm，對菌懸液進行不同時間的誘變處理。將培養皿置30℃恒溫箱避光培養2 d(誘變過程均應在無光或者紅光下操作，以避免光復活現象的發生影響誘變效果)。進行菌落記數，按下式計算致死率：

1.2.2 低能離子束誘變［10-11］吸取1 mL對數生長期的種子液，加入到裝有9 mL無菌水的試管中，吸取0.1 mL菌液均勻的涂布在無菌培養皿上，于超凈工作臺中自然干燥，用氮離子(N+)照射處理。誘變后用1 mL無菌水洗滌平皿，吸取0.1 mL誘變后菌液涂布于平板上培養。30℃恒溫箱培養2 d。進行菌落記數，計算致死率。

1.2.3 誘變菌株篩選從誘變后的平板挑取單菌落于斜面培養基中，30℃恒溫箱培養，24 h后挑取1環接種于種子培養基。24 h后取5 mL接種于發酵培養基中，發酵38 h進行酶活檢測。計算正突變率。取酶活最高的菌株為目標菌株。圖1為誘變選育的流程。

圖1 誘變選育流程圖Fig.1 Schematic drawing of mutation and screening process

1.2.4 遺傳穩定性的測定選取試驗中酶活最高的誘變菌株，連續傳代5代，測定每一代腈水解酶酶活，比較其變化。

1.2.5 細胞轉化取0.2 g搖床培養38 h的發酵液離心得到的菌體，用10 mL pH 8.0的磷酸鹽緩沖液制成菌懸液。加入底物亞氨基二乙腈，35℃水浴搖床反應6 h，取1 mL反應液離心，取上清液HPLC分析。

1.2.6 酶活定義35℃條件下，1 min內轉化底物得到1 μmol亞氨基二乙酸所需要的酶量定義為1個酶活單位U。

1.2.7 分析方法產物測定：Sil-20A型高效液相色譜儀，色譜柱為Hypersil SAX 5(4.6 mm×250 mm ID);流動相為濃度20 mmol/L的磷酸氫二銨緩沖液(磷酸調pH至4.0)，柱溫為30℃;檢測器為紫外檢測器，檢測波長為210 nm，以峰面積外標法定量。

2 結果與分析

2.1 菌體生長曲線的繪制

ZJB09133生長曲線見圖2。由圖2可知，菌體在16 h進入對數生長期，32 h后進入穩定期。根據曲線，選擇培養24～28 h的菌體進行誘變。

圖2 ZJB09133菌體生長曲線Fig.2 Growth curve of ZJB09133

2.2 紫外-氯化鋰復合誘變

圖3 紫外-氯化鋰誘變致死曲線Fig.3 Lethality curve of UV-LiCl mutation

紫外線(UV)的誘變機理是其能引起DNA結構變化。DNA分子強烈地吸收紫外線、可引起DNA鏈的斷裂、DNA分子內部和分子間的交聯、核酸與蛋白質的交聯、嘧啶水合作用以及形成嘧啶二聚體。本研究對菌體分別照射5、10、15、20、25、30 s，計算致死率，得到誘變劑量與致死率的關系，結果見圖3。由圖3可知，隨著紫外線照射時間的延長，致死率也增大，當照射時間為高于30 s時，致死率高于99%，根據微生物育種研究經驗可認為致死率以90.0%～99.9%效果較好，但也有報道認為較低的致死率有利于正突變菌株的產生，而較高的致死率往往導致負突變率的提高［12］。在本研究中當照射時間為15 s時，其正突變率是最高的，達到20%，此時致死率在80%左右。所以選擇15 s作為誘變的劑量。

2.3 低能離子束誘變

2.3.1 注入劑量與菌落存活數關系離子束對生物體有能量沉積和質量沉積雙重作用，從而使生物體產生死亡、自由基間接損傷、染色體重復、易位、倒位或使DNA分子斷裂、堿基缺失等多種生物學效應。氮離子注入量30×2.3×1013、60×2.3×1013、90×2.3×1013、120×2.3×1013、150×2.3×1013ions/cm2，注入能量15 kev，靶室真空度10－3Pa，脈沖注入，繪制劑量與存活量關系圖。

如圖4所示，糞產堿桿菌細胞隨著N離子注入劑量的增加，菌種的存活數先減小后增大，然后又變小，形成典型的“馬鞍型”劑量-效應曲線［13］。這種特有的“馬鞍型”變化被認為是能量、動量作用下的損傷效應和質量、電荷作用下的保護和刺激效應綜合作用的結果［14-15］。

圖4 注入劑量與菌落存活數(CFU)的關系Fig.4 The relationship between implantation dosage and amount of colonies surviving

2.3.2 各注入劑量的正負突變率通過每個劑量各挑取50株菌株，計算其正負突變率，結果如圖5所示，當劑量為60×2.3×1013ions/cm2其誘變的正突變率最高，達到22%。

圖5 不同注入劑量的正負突變率Fig.5 The positive，negative mutation rate of different implantation dosage

2.4 遺傳穩定性的研究

經單獨、復合多次誘變，通過篩選從500株誘變株中選取4株酶活最高菌株，分別命名為D121、D132、UL44、UL152，連續5次傳代培養，以測定其遺傳穩定性，結果見表1。以相對于未傳代誘變菌株的酶活變化率作為評價指標。4株菌株酶活變化幅度較小，證明該菌株的遺傳性能穩定。

表1 高產菌株傳代穩定性的研究Table 1 The assessments of genetic stability

3 結論

現代微生物誘變育種理論認為，當誘變的微生物致死率在70%～75%左右時，產量性狀的正突變率往往很高，而更高的致死率下，雖然突變率較高，而正突變率卻很低。在本研究中取得了與上述結論相似的結果。當紫外照射時長為15 s時，也就是致死率大約為80%的時候，正突變率是最高的，達到20%。以Alcaligenes faecalis ZJB09133為出發菌株，采用UV-LiCl，離子注入進行誘變處理，當紫外照射時間和離子注入量分別為15 s和60×2.3×1013ions/cm2時，正突變是最高，分別達到20%和22%。

在挑取的所有菌落中，最終得到了4株腈水解酶酶活較高的菌株，且經過連續5代的傳代培養，酶活沒有明顯的下降，其中UL44酶活是最高的，達到74.6 U/g，比初始菌株酶活提高124.5%。

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