以Kla值優化L-谷氨酸發酵的供氧條件

宋翔，魏文靜，涂鄭禹，孫玉春，陳寧

（1.天津渤海職業技術學院，天津300402；2.天津科技大學，天津300222）

以Kla值優化L-谷氨酸發酵的供氧條件

宋翔1，魏文靜1，涂鄭禹1，孫玉春1，陳寧2

（1.天津渤海職業技術學院，天津300402；2.天津科技大學，天津300222）

以Kla（體積溶氧系數）值為重要參考對黃色短桿菌進行了分批補料發酵過程中有關供氧條件的研究。在10L臺式發酵罐中進行補料分批發酵，當Kla為377 h-1左右時，供氧比較適宜，可發酵產生130g/LL-谷氨酸。

L-谷氨酸；供氧；發酵；Kla值

谷氨酸化學名為α-氨基戊二酸，它是生物機體內氮代謝的基本氨基酸之一，在代謝上具有十分重要的意義。谷氨酸具有多種生理功能[，廣泛用于食品，醫藥及飼料行業。谷氨酸發酵作為典型的代謝控制發酵，是工業微生物發酵工藝與過程控制的典型代表。1957年Kinoshita等[1]創立微生物發酵法生產谷氨酸，開創了發酵法氨基酸工業化生產的新紀元，使得發酵法生產氨基酸成為工業微生物最重要的研究領域之一[2～4]。

反應器中氧參與菌體生長、產物形成和細胞代謝。氧是難溶于水的氣體，在室溫及常壓下，純氧的溶解度僅為36 mg/L，空氣中氧的溶解度僅為8 mg/L，當水中溶有糖或其它鹽類時，氧的溶解度更低。在通風發酵中如何控制培養基中溶氧水平，對好氧氨基酸發酵非常關鍵，尤其在放大過程中，因反應器規模不同，造成溶氧水平的差異，是導致發酵結果不能重復的一個重要原因。在反應器放大研究中，Kla是一個重要的參數，不同規模的反應器中，氧傳遞系數與發酵結果之間存在著對應關系，目前Kla放大準則已成為生物化工界一個廣泛接受的觀點。可見在小型反應器中研究溶氧對發酵的影響，尋求最適Kla值不僅是發酵工業研究的關鍵之一，而且是反應器放大研究的重要基礎。在谷氨酸發酵過程中，前期主要為菌體生長階段，需要一定量氧參與，若氧的供應受到限制，就會影響菌體生長，進而影響到最終的L-谷氨酸產量;在L-谷氨酸合成階段，氧也是必不可少的底物之一，供氧不足會嚴重影響L-谷氨酸的合成。

1 材料與方法

1.1 菌種

黃色短桿菌

1.2 培養基

[5]。

1.3 培養方法

1.3.1 斜面活化培養：32℃培養20 h。

1.3.2 種子培養：500mL圓底三角瓶中裝液量30mL，9層紗布封口，置巡回式搖床（200 r/min）上，32℃振蕩培養8 h。

1.3.310 L罐發酵：中裝液量為6 L，接種量為10%，溫度有34℃程序升溫至39℃，通風比為1∶1，流加氨水控制pH在7.0～7.2，攪拌轉速根據要求而定。

1.4 分析方法

1.4.1 pH的測定:用pH6.4～8.0精密pH試紙和發酵罐配套pH電極測定。

1.4.2 殘糖測定:采用SBA-40C生物傳感分析儀測定。

1.4.3 菌體濃度測定:稀釋20倍，用752分光光度計在波長620 nm處測定。

1.4.4 谷氨酸含量的測定：采用SBA-40C生物傳感分析儀測定。

2 結果與討論

2.1 搖瓶溶氧系數的測定

為了給發酵放大提供依據，首先用亞硫酸鹽氧化法對500 mL圓底三角瓶溶氧性能進行了測定。在相同搖瓶轉速條件下（回轉式搖床200 r/min），測定了不同裝液量的搖瓶溶氧系數。結果見表1。

表1 搖瓶溶氧系數的確定

通過溶解氧性能測定可以看出，在固定搖床轉速的條件下，對于同種規格的500 mL圓底三角瓶，減少裝液量可以使溶氧加大。

2.210 L發酵罐溶氧系數的測定

要將搖瓶中的各項優化條件在大規模培養中完全重現是相當困難的，尤其是溶氧的控制尤為關鍵。為了使微生物培養過程溶解氧參數系統化，并有依據地將其放大進行工業化生產，在相同的通氣量的條件下（200 L/h），本試驗對不同的轉速下10 L發酵罐的溶氧系數進行了測定。結果見表2。

表210 L發酵罐溶氧系數的測定

在相同的通氣量的條件下，從試驗測定的反應器中不同轉速下的溶氧系數可知，當10 L發酵罐裝液量為6 L，轉速為500 r/min，通氣量為200 L/h的溶氧系數，與回轉式搖床500 mL三角瓶裝液量30 mL時的溶氧系數接近。

2.3 Kla值與發酵罐溶氧的關系

已有的研究報道認為較低的溶氧有利于L-谷氨酸的積累。通過以上的實驗研究表明搖瓶發酵過程中確定的最佳裝液量為30 mL，溶氧系數為390 h-1，對應發酵罐的轉速為500 r/min左右。試驗中通過改變攪拌轉速來控制不同的Kla值，在發酵培養基組成和其它發酵條件相同的情況下，考察了不同Kla值對應發酵過程溶氧變化的情況，結果見圖1。

圖1 10 L發酵罐不同Kla下溶解氧的變化

如圖1所示，在控制不同的Kla值的發酵過程中，溶氧均表現出相似的變化規律，但發酵的不同階段對氧的需求不同。在發酵初期（0～12 h），菌體好氧速率明顯快于供氧速率，表現為溶氧的迅速下降；而18 h后，好氧速率和供氧速率基本保持平衡。發酵末期（30 h后），溶氧略有回升;發酵結束溶氧達10%左右。

2.4 Kla值對發酵產酸的影響

試驗中通過改變攪拌轉速控制不同的Kla值，從而達到控制發酵液的溶氧水平。發現過高或過低的溶氧對發酵均不利；當溶氧很低時（Kla=289 h-1）對發酵尤為不利，表現為產酸水平降低和發酵時間延長；將Kla值控制在377～512 h-1之間時，發酵結果較好，試驗結果見表3。

表3 不同Kla值對發酵產酸的影響

2.5 不同Kla值時的發酵菌體生長曲線

圖2為發酵過程中菌體生長曲線，在不同的Kla值時（除非Kla很小），菌體的生長量均能達到基本相同的飽和值，但菌體的生長速率是不同的。結果發現當Kla=377 h-1時，菌體的比生長速率最大；而過高的Kla值反而對菌體的生長有抑制作用。

圖2 不同Kla值時的發酵菌體生長曲線

2.6 L-谷氨酸補料分批發酵過程曲線

以黃色短桿菌GDK-9為試驗菌株，在7L自控發酵罐上進行L-谷氨酸發酵試驗并繪制其發酵過程曲線，結果如圖3所示。

圖310 L發酵罐發酵過程曲線

由圖3看出，0～2h為菌體生長的延滯期,此時菌體耗糖速率較慢,主要用于長菌,基本不產酸；2～ 12 h為菌體對數生長期,耗糖速率最快,并急劇產酸；12～36 h菌體進入穩定期,在此階段,菌體耗糖速率較快,L-谷氨酸大量合成,36 h后為菌體衰退期,這時菌體耗糖速率減慢,L-谷氨酸合成緩慢或基本不合成。發酵36 h,L-谷氨酸產量為130 g/L。

參考文獻：

［1］Kinoshita,S.,Udaka,S.,Shimono,M.,1957.Studies on the amino acid fermentation.I.Production of L-glutamic acid by various microorganisms[J].Gen.Appl.Microbiol.1957,3,193-205.

［2］Arnold L.Demain.Small bugs,big business the economic of the microbe[J].Biotechnology Advances,2000,18:499-514.

［3］ThomasHermann.Industrialproductionofaminoacidsbycoryneform bacteria[J].JournalofBiotechnology,2003,104:155-172.

［4］Volker F Wendisch,Michael Bott,Bernhard J Eikmanns.Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic acids and amino acids[J]. Current Opinion in Microbiology,2006,92:68-274.

［5］郜培,陸靜波,段作營,等.溶氧濃度對谷氨酸發醉關鍵酶的影響[J].食品與發酵工業,2005,31（10）：72-75.

Optimization of oxygen supply of L-glutamic acid fermentation by Kla value

SONG Xiang1,WEI Wen-jing1,TU Zheng-yu1,SUN Yu-chun1,CHEN Ning2
(1.Tianjin Bohai Vocational Technical College,Tianjin 300402,China；2.Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300222,China)

The oxygen supply of L-glutamic acid fermentation was optimized by Kla value.The research indicated that when the Kla value was about 377 h-1,the oxygen supply was most suitable for the fermentation and 130g/L L-glutamic acid was accumulated.

L-glutamic acid；oxygen supply；fermentation；Kla value

10.3969/j.issn.1008-1267.2011.03.008

TQ922+.1

A

1008-1267（2011）03-0026-03

2011-01-28