HPLC法測(cè)定知柏地黃丸中菝葜皂苷元的含量

陳驍勇（江蘇鹽城市第一人民醫(yī)院，鹽城市 224001）

知柏地黃丸是一種常用中成藥，由知母、黃柏、熟地黃等幾味藥組成，具有滋陰、降火的功效，用于陰虛火旺、潮熱盜汗、口干咽痛、耳鳴遺精、小便短赤[1]。為有效、準(zhǔn)確的控制知柏地黃丸的質(zhì)量，筆者以知母皂苷的水解產(chǎn)物菝葜皂苷元為檢測(cè)指標(biāo)[2]，通過(guò)方法學(xué)研究，建立了知柏地黃丸中菝葜皂苷元的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

Aglient 1200型高效液相色譜儀，包括G1311A四元泵高效液相色譜儀、G1322A真空脫氣機(jī)、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、Varian 380-LC蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、Aglient色譜工作站（美國(guó)安捷倫科技有限公司）。

菝葜皂苷元對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0744-200005）；知柏地黃丸（市售，批號(hào)：091208、100308、20090501）；甲醇為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Aglient C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（95∶5）；檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；流速：1 mL·min－1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：25 ℃。理論板數(shù)按菝葜皂苷元峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000[3]。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取菝葜皂苷元對(duì)照品適量，加甲醇制成每1.0 mL含0.2 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取本品1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙醇20 mL，稱定重量，浸泡過(guò)夜。超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，加水10 mL，鹽酸1 mL，加熱回流2 h，取出，冷至25℃，邊振搖邊滴加40%氫氧化鈉溶液至溶液顏色由橙黃突變?yōu)槌燃t。用三氯甲烷振搖提取2次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取不含知母的處方藥味，按知柏地黃丸的制備工藝，制成陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取濃度為0.217 3 mg·mL－1的菝葜皂苷元對(duì)照品溶液適量，分別精密吸取2、3、5、10、20 μL，按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣。以峰面積積分值（Y）的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝1.639 5 X+11.548（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，菝葜皂苷元進(jìn)樣量在0.44～4.35μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各20μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果，陰性對(duì)照溶液在與菝葜皂苷元對(duì)照品相同保留時(shí)間處未見(jiàn)色譜峰，故認(rèn)為陰性對(duì)照無(wú)干擾。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference solution；B.test solution；C.negative control solution

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20μL。結(jié)果，RSD＝0.78%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h分別測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD＝1.7%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果，菝葜皂苷元平均含量為0.296 mg·g－1，RSD＝1.2%，表明該法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批號(hào)（批號(hào)：20090501，含量：0.296 mg·g－1）供試品約0.8、1.0、1.2 g，各3份，精密稱定，分別精密加入“2.2.1”項(xiàng)下的菝葜皂苷元對(duì)照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品含量測(cè)定

取3個(gè)批號(hào)的知柏地黃丸適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recorery tests（n＝9）

表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination for samples（n＝3）

3 討論

知柏地黃丸是一種常用中成藥，是由補(bǔ)陰經(jīng)典代表方劑六味地黃丸（熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓）加知母、黃柏而成，加強(qiáng)了滋腎陰、清相火的作用。近年來(lái)經(jīng)中醫(yī)辯證后靈活使用，對(duì)慢性咽炎、急性尿路感染等幾種疾病也有較好療效。

知柏地黃丸最主要成分為知母，而知母有效成分為多種甾體皂苷，其皂苷主要為菝葜皂苷元。知母根莖中含甾體皂苷約為6%，有知母皂苷 A1、A2、A3、A4、B1、B2等。菝葜皂苷元為知母中幾種主要甾體皂苷的母核皂苷元[4]，因此可通過(guò)測(cè)定菝葜皂苷元的含量對(duì)知母藥材的質(zhì)量進(jìn)行控制，進(jìn)而有效、準(zhǔn)確地控制知柏地黃丸的質(zhì)量。

綜上所述，本法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，加樣回收率高，可用于知柏地黃丸的質(zhì)量控制。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：820.

[2] 成旭東，賈曉斌，陳 彥，等.反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定酸棗仁濃縮丸中菝葜皂苷元的含量[J].中國(guó)藥房，2007，18（3）：204.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：148.

[4] 沙東旭，陳桂范，張滿來(lái).高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定知母中菝葜皂苷元的含量[J].藥物分析雜志，2005，25（8）：952.