失血性休克大鼠腸上皮細胞PGC-1基因表達改變及意義

李偉文，陸松敏，方傳勤，劉建倉，郭素清，程 鳳，王正國

線粒體基因組與核基因組在遺傳信息表達上關系密切。調控線粒體基因表達的核轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1，PGC-1)通過與調節基因表達的結合轉錄因子相互作用行使功能，調節核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1，NRF1)和NRF2等基因的表達，執行特異的細胞程序，能誘導線粒體生物合成、呼吸和生熱作用［1］。PGC-1在適應性產熱、線粒體生成等過程中有著重要作用［2］。國內外文獻尚缺乏失血性休克時細胞PGC-1基因的表達變化規律的相關報道。本實驗觀察了PGC-1在失血性休克缺血缺氧條件下大鼠腸上皮細胞中表達的變化情況，以探討核轉錄因子對編碼呼吸鏈亞基的細胞核基因組和線粒體基因組表達的影響，揭示線粒體能量代謝障礙發生的原因。

材料與方法

1 采用轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測失血性休克大鼠腸上皮細胞核編碼基因PGC-1mRNA的表達變化

1.1 動物模型的制作［3］健康Wistar大鼠，體重(250±20)g，由第三軍醫大學野戰外科研究所動物實驗中心提供。將36只隨機等分為6組:(1)休克前組(對照組);(2)休克1小時組(HS 1小時);(3)休克2小時組(HS 2小時);(4)休克3小時組(HS 3小時);(5)休克4小時組(HS 4小時);(6)休克5小時組(HS 5小時)。動物快速放血(10分鐘內)使血壓降至 40mmHg(即5.32kPa)，休克1、2小時組分別維持1、2小時;休克3、4、5 小時組均維持 2 小時后分別觀察 1、2、3 小時。休克前組處理同上，僅不放血。

1.2 核編碼基因PGC-1mRNA水平的檢測 于以上各時相剖腹取小腸制備腸上皮細胞［4］，參照文獻［5］提取腸上皮細胞RNA，進行反轉錄，PCR擴增，將產物用2%瓊脂糖凝膠電泳。100V，5分鐘;50V，55分鐘后觀察并拍照。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。RT-PCR采用TaKaRa RNA PCR kit(AMV)寶生物工程(大連)有限公司產品。PGC-1引物

1A(bp 1945)5’-CGCAGAGAGTATGAGAAGCG-3’，

1B(bp 2179) 5’-AAGCGTCACAGGTGTAACGG-3’擴增長度 235bp β-actin引物

5’-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3’5’-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATGGAGG-3’擴增長度275bp

2 采用Western-blot法檢測腸上皮細胞PGC-1蛋白的表達變化

2.1 主要試劑 一抗:兔抗小鼠PGC-1單克隆抗體(美國，Chemicon公司)，二抗:辣根過氧化酶(HPR)標記的羊抗兔IgG(美國，Chemicon公司)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中山公司)，抗體稀釋液(北京中山公司)，低分子量蛋白Marker(上海麗珠東風生物技術公司):14.4KD～97.4KD，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(NENTMlife science)，麗春紅S(Sigma)，牛血清白蛋白(Roche)，細胞總蛋白裂解液(Pierce)。

2.2 細胞總蛋白提取 細胞1×107個，加入200μl冰預冷的總蛋白提取液，冰浴中勻漿，4℃裂解30分鐘，4℃ 12 000g離心10分鐘，保留上清液，即為全細胞總蛋白。Bradford法測定蛋白含量后，分裝并于-70℃保存備用。

2.3 Western免疫印跡(Westernblot) 取60μg蛋白，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)后，電轉移至PVDF膜，將PVDF膜放入封閉液［Tris緩沖鹽溶液(TBS)配制的5% 脫脂奶粉中］4℃封閉4小時，TBS液漂洗后加1:100稀釋的一抗，37℃孵育2小時。TBS洗膜后加1:1000稀釋的二抗，37℃孵育1小時。按DAB顯色試劑盒使用說明操作，進行化學發光法顯色，暗室顯影、定影后觀察結果。

2.4 統計分析 利用數字化凝膠分析儀分析得出各條帶面積光強度值，進行統計學分析。數據均以均值±標準差(±s)表示，采用t檢驗確定組間差別，P＜0.05為差別顯著，P＜0.01為差別非常顯著。

結 果

1 失血性休克大鼠腸上皮細胞PGC-1mRNA水平的變化

本實驗中PGC-1、β-actinmRNA PCR產物分別為235bp和275bp。對照組和所有休克組RNA提取以及PCR擴增產物電泳加樣量都是相同的，這樣就排除了因加樣量不同而造成假陽性和假陰性。

正常情況下，腸上皮細胞核編碼基因PGC-1 mRNA有較低程度表達，失血性休克1小時大鼠腸上皮細胞PGC-1 mRNA表達開始增加，2小時達高峰并維持到3小時，后又開始減弱，到休克晚期5小時PGC-1mRNA表達顯著弱于休克前(P＜0.05)(見表1、圖1)。

2 失血性休克腸上皮細胞PGC-1蛋白的表達

Western-blot結果顯示，正常大鼠腸上皮細胞PGC-1蛋白含量較低。失血性休克1小時大鼠腸上皮細胞PGC-1蛋白含量基本沒有變化。失血性休克2小時，即休克中期PGC-1蛋白表達增強，后又漸減弱，失血性休克5小時已明顯弱于休克前，結果見表2、圖2。

表1 失血性休克大鼠腸上皮細胞核編碼基因PGC-1mRNA的表達變化(n=6，光強度比值，±s)

表1 失血性休克大鼠腸上皮細胞核編碼基因PGC-1mRNA的表達變化(n=6，光強度比值，±s)

與正常對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 對照組HS1h HS2h HS3h HS4h HS5h PGC-1/β-actin0.4634±0.0631 0.703±0.0965*0.7746±0.0896＊＊0.7585±0.0865＊＊ 0.5586±0.0466 0.3082±0.0585*

表2 失血性休克大鼠腸上皮細胞核編碼基因PGC-1蛋白的表達變化(n=3，光強度值，±s)

表2 失血性休克大鼠腸上皮細胞核編碼基因PGC-1蛋白的表達變化(n=3，光強度值，±s)

與正常對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 對照組HS1h HS2h HS3h HS4h HS5h PGC-1蛋白 0.7642±0.0313 0.7538±0.0475 0.8943±0.0496＊＊0.8848±0.0585＊＊ 0.7589±0.0425 0.6764±0.0475*

圖1 失血性休克大鼠腸上皮細胞PGC-1基因mRNA的改變

圖2 失血性休克腸上皮細胞線粒體PGC-1蛋白雜交結果

討 論

PGC-1能結合多種轉錄因子增強靶基因轉錄效率，參與多種代謝通路的調節活動［6］。PGC-1異常表達可引起與線粒體生理功能及能量代謝相關的細胞反應。在棕色脂肪、肌肉和心肌中，傳遞能量需求的信號可使PGC-1表達增高，PGC-1的過度表達刺激線粒體的生物合成。認識這種多功能輔激活因子在失血性休克時缺血缺氧所致損傷細胞中表達變化情況具有重要意義。

1 PGC-1生理作用及其調節機制

PGC-1是染色體4p15.1區域的基因編碼的一種核受體刺激因子。人類PGC-1開放讀碼框(openreading frame，ORF)包含2 394個核苷酸，編碼798個氨基酸，分子量91kDa。大鼠的PGC-1氨基酸序列與人類有95%的一致性，與小鼠有98%的一致性，分別與人類和小鼠的PGC-1有1個和2個N端氨基酸缺失的差異。人類、大鼠和小鼠PGC-1的功能基序大多是高度保守一致的［7］。PGC-1的 N末端轉錄活性區，是與幾種轉錄因子相互作用的區域，命名為AD1和AD2;C末端與處理新轉錄的RNA有關。PGC-1上還有 NRF等的結合位點。PGC-1通過直接的蛋白-蛋白相互作用方式輔激活轉錄因子［7］，能參與對染色質的修飾，與RNA聚合酶Ⅱ復合體相互作用，對mRNA加工，結合其他輔激活因子等，還能與TRAP/Mediator復合體相互作用［8］。PGC-1α 能被 p38 MAPK 激活。p38 MAPK對PGC-1的正調節作用機制是通過解除p160MBP與PGC-1的負調節結構域結合，從而消除其負調節作用［9］。

2 失血性休克大鼠缺血缺氧腸上皮細胞輔激活因子PGC-1表達的改變及意義

本實驗中發現，在失血性休克時，大鼠腸上皮細胞中PGC-1 mRNA表達在休克早期表達開始增強，2小時和3小時表達最強，后又漸減弱，至休克5小時時其表達明顯低于休克前水平。有報道高濃度過氧化氫可促進骨骼肌細胞PGC-1 mRNA表達，該過程與腺苷酸激酶(AMP kinase)激活有關［10］。說明缺血缺氧早期可上調PGC-1 mRNA，可能與氧自由基生成增多有關。PGC-1 mRNA的上調，可以使PGC-1蛋白合成增多，為PGC-1功能增強創造條件，以便適應細胞能量供應不足時線粒體加強能量代謝的過程，刺激線粒體的生物合成。而休克失代償期細胞內與基因表達有關的能量和原料供應均減少，擾亂了PGC-1在轉錄水平的表達，從而下調了PGC-1 mRNA的表達，繼而使PGC-1輔激活轉錄因子的能力減弱，相對抑制了編碼呼吸鏈亞基的細胞核基因組和線粒體基因組的表達，更加重了線粒體的能量代謝障礙。

本研究發現，大鼠失血性休克2小時腸上皮細胞PGC-1蛋白表達量有所增高，后開始下降，到休克晚期5小時時，與正常對照組相比，其蛋白含量非常顯著降低(P＜0.01)。說明在休克早期，PGC-1 mRNA的上調，能使PGC-1蛋白合成增多，從而誘導細胞適應能量代謝需要基因的表達，并加強了線粒體能量代謝的過程。隨著休克的發展，PGC-1 mRNA表達下降，PGC-1蛋白合成減少，輔激活轉錄因子的調節能力減弱，細胞能量生成障礙，細胞及其線粒體損傷更趨嚴重。推測如能阻止PGC-1蛋白表達的下降，可能會減輕休克時細胞及其線粒體的損傷。Srivastava等［11］研究證實，通過誘導PGC-1α/β表達，可以部分彌補線粒體疾病患者存在的細胞呼吸鏈功能的缺陷，增加線粒體生物合成。國內陳淑娟等［12］實驗結果亦表明，增加PGC-1α在內皮細胞內的表達，可以增加線粒體生物合成，反之，可降低線粒體生物合成。目前，PGC-1在調控通路中的作用的更多研究正在深入進行，而有關失血性休克缺血缺氧條件下PGC-1基因表達的調控研究將無疑具有一定的臨床應用前景。

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