超高效液相色譜——三重四級桿質譜測定乳與乳制品中氯霉素的殘留

鞏軍,褚中秋,姜金斗,周紅

(1.農業部乳品質量監督檢驗測試中心，哈爾濱 150090；2.國家乳制品質量監督檢驗中心，哈爾濱 150086）

超高效液相色譜
——三重四級桿質譜測定乳與乳制品中氯霉素的殘留

鞏軍1,褚中秋1,姜金斗1,周紅2

(1.農業部乳品質量監督檢驗測試中心，哈爾濱 150090；2.國家乳制品質量監督檢驗中心，哈爾濱 150086）

建立了乳與乳制品中氯霉素殘留的超高效液相色譜——三重四級桿測定方法。該方法采用電噴霧電離源、多重反應監測負離子模式，可對氯霉素殘留進行定性和定量測定。該方法的檢出限為牛奶0.05 μg/kg，乳粉為0.1 μg/kg，線性范圍在0.4～30.0 μg/L內的回歸方程為y=798.97+1874.56x，r=0.9993，加標回收率75.0%～94.6%，相對標準偏差為4.2%～12.8%。該法具有樣品處理簡單方便，靈敏度高，分析時間短等優點，可以滿足乳與乳制品中氯霉素殘留的測定。

超高效液質聯用儀；氯霉素；殘留

0 引言

氯霉素是一種廣譜抗生素，在奶牛上屬禁用的抗生素。但因其價格低廉、治療效果好等而使個別地區、個別奶農違規使用[1]，從而造成了生乳及相關產品中氯霉素的殘留的存在，給消費者的健康帶來潛在的危害。2011～2012年度農業部及質檢總局也將氯霉素等抗生素納入到生乳與乳制品風險監測中，并在個別地區檢出氯霉素殘留。目前檢測氯霉素殘留的方法主要包括：酶聯免疫法、液相色譜法、氣相色譜法、液-質聯用法和氣-質聯用法等[2-5]，同時也制定了測定動物源性食品中氯霉素測定的國家標準、行業標準[6-7]，但在適用范圍中都未涵蓋乳及乳制品，處理方法也不適用于該類產品。為此，我們根據乳與乳制品的特性，為能準確定性定量測定痕量氯霉素殘留，基于超高效液相色譜儀快速、高效分離的特點，結合三重四極桿質譜高靈敏的的定性定量功能，建立了適于乳與乳制品中痕量氯霉素殘留測定的、具有操作簡單、靈敏度高、測定時間短等優點的UPLC-MS-MS方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

用于流動相的乙腈為色譜純試劑；用于樣品處理的乙腈、正己烷、乙酸乙酯、高氯酸均為分析純試劑；氯霉素標準品(純度大于99.5%)。

1.2 儀器

Waters AcQuity超高效液相色譜、Waters Xevo TQ MS質譜儀。

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters BEH-C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；柱溫為30℃；樣品室溫度為10℃；流速為0.35 mL/min；進樣量為5 μL；流動相為乙腈+水，洗脫梯度如表1所示。

表1 梯度洗脫條件

1.4 質譜條件

離子化模式為ESI―；毛細管電壓為2.20 kV；錐孔電壓為30 V；脫溶劑氣溫度為450℃；脫溶劑氣流速為800 L/h；錐孔氣流速為20 L/h；源溫度為150℃。

1.5 樣品處理

1.5.1 牛奶

稱取5 g(精確至0.1 mg)至30 mL離心管中，加入5 mL乙腈充分混勻，超聲提取10 min，以5 000 r/min離心10 min，將上清液轉入另一30 mL離心管中；再加入5 mL乙腈至殘渣中漩渦混勻，重復提取一次，合并上清液，用乙腈定容至15 mL，混勻；加入5 mL乙腈飽和正己烷，渦旋混勻1 min，靜置分層，棄去正己烷層。再加入5 mL飽和正己烷，重復上述步驟。將乙腈層全部轉移至旋轉蒸發瓶中，50℃真空旋轉蒸發近干，用50%乙腈淋洗蒸發瓶，定容至1 mL，用0.45 μm濾膜過濾，進樣10 μL進行測定。

1.5.2 乳粉

稱取1 g(精確至0.1 mg)乳粉至30 mL離心管中，加入3 mL 40℃水充分溶解，渦旋混勻1 min，加入5 mL乙腈充分混勻，超聲提取10 min，其余步驟同1.5.1。

2 結果與分析

2.1 樣品處理的優化

牛奶及乳粉特別是配方乳粉中成分復雜，蛋白質含量較高，氯霉素屬于弱極性化合物，在水中溶解性較差，易溶于甲醇、乙腈等有機溶劑。據此我們采用乙腈直接萃取后，用乙腈飽和的正己烷進行脫脂凈化。凈化后的乙腈溶液采用真空濃縮的方式蒸干后用50%乙腈溶液溶解殘渣進行測定。利用超高效液相分離速度快、分離度高的優勢無需再進行固相萃取凈化就可直接上機測定。經試驗對比：采用文獻報道的5%高氯酸沉淀蛋白質處理后直接上機測定的方法[8]，發現由于樣液酸性及本地干擾過大等不利于分離測定；采用乙酸乙酯提取對部分乳制品樣品而言由于極易產生乳化現象，即使加入氯化鈉也難以分層，致使樣品處理困難，提取效率低；而采用固相萃取既耗時、成本又高。本實驗中采用的方法經加標回收等實驗證實具有較高的穩定性和滿意的提取效率。

2.2 質譜條件的優化

利用儀器本身自動優化的功能，采用200 ng/mL的氯霉素標準溶液以流動注射的方式在負離子模式下進行錐孔電壓、碰撞電壓等質譜條件的優化并對母離子進行全掃描，確定氯霉素的分子離子為m/z 321。然后以上述離子為母離子，對其子離子進行全掃描，在已優化的質譜測定條件下主要子離子m/z為152.1、257.1。據此我們確定定性離子采用m/z321/152.1、321/ 257.1；定量離子采用m/z 321/152.1。這與有關標準及文獻中提供的定性、定量離子（320.9/151.9、320.9/ 256.9）基本一致[6、8]。

2.3 色譜條件的優化

由于氯霉素屬于弱極性化合物，在水中溶解性較差，易溶于甲醇、乙腈等有機溶劑。本方法直接采用水-乙腈為流動相，利用梯度洗脫（見表1）的方法縮短分離時間，提高分離效果。有關文獻及標準中的流動相一般要配以5～10 mmol/L乙酸胺溶液以提高分離度[6，8]。但對于超高效液相而言，由于流量小、流速低、壓力大、管線細等特點應盡量不采用含鹽的流動相等，以利于防止管路堵塞；特別是利于質譜測定，減小錐孔等污染。利用儀器分離效率高的優勢只采用水-乙腈作為流動相就可達到滿意的分離效果，且整個測定過程僅需5 min即可全部完成，如圖1所示。

2.4 線性范圍與檢出限

將逐級稀釋的標準工作液分別進樣10 μL，以定量離子測定結果進行線性回歸計算，線性范圍為0.4～30 μg/L，回歸方程y=798.97+1874.56x(y為峰面積；x為質量濃度，μg/L)，相關系數r=0.9993。以不含氯霉素的滅菌乳、全脂奶粉作為本底3倍噪音計算出的最低檢出限分別為0.05 μg/kg、0.1 μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

分別選取滅菌乳與全脂乳粉，按1.5稱取樣品至30 mL離心管中，分別添加氯霉素標準溶液后進行樣品處理。每個質量分數同時添加6個樣品進行精密度測定，檢測質量分數為6個平行樣品的平均值。回收率與精密度測定結果如表2所示。

3 結論

表2 樣品中氯霉素的回收率與相對標準偏差

（1）建立了乳與乳制品中氯霉素殘留的超高效液相色譜——三重四級桿質譜聯用測定方法。該法樣品操作簡單、成本低、測定周期短、靈敏度高等優點。

（2）通過對樣品處理方法的優化，彌補了相關標準中對乳與乳制品類樣品處理方法的缺失。且該處理方法即可減小本底干擾，提高回收率，又可明顯提高測定的靈敏度。最低檢出限牛奶為0.05 μg/kg、奶粉為0.1 μg/kg。

（3）該方法線性范圍較寬，在0.4～30 μg/L的范圍內呈良好的線性關系。回歸方程為y= 798.97+1874.56x，相關系數r=0.9993。

（4）樣品加標回收率在75.0%～94.6%，相對標準偏差為4.2%～12.8%。完全能滿足痕量成分定量測定的要求。

[1]中華人民共和國公告第235號，附錄4：禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出.

[2]農業部1025號公告-26-2008動物源食品中氯霉素殘留檢測酶聯免疫吸附法.

[3]潘瑩宇，許茜，康學軍，等.高效液相色譜熒光檢測法測定牛奶中氯霉素的殘留量[J].色譜，2005（11）：577-580.

[4]彭莉,程江,高嵐等.牛奶中氯霉素殘留的氣相色譜測定法研究[J].中國獸藥雜，2006(9):14-17.

[5]李鵬，邱月明，蔡慧霞.氣相色譜——質譜聯用法測定動物組織中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素的殘留量[J].色譜，2006(1):14-18.

[6]GB/T 22338-2008動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定[S].

[7]中華人民共和國公告第236號，動物源性食品中獸藥檢測方法[S].

[8]劉艷琴，王浩，殷曉燕.高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜測定乳品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留的研究[J].食品科學，2008（4）：344-346.

Study on UPLC-MS-MS determination of chloramphenicol residues in milk and dairy

GONG Jun1，CHU Zhong-qiu1，JIANG Jin-dou1，ZHOU Hong2
(1.Ministry of Agriculture Dairy Quality Supervision and Testing Center，Harbin 150090，China;2.National Dairy Quality Supervision and Inspection Center,Harbin 150086，China)

This study of chloramphenicol residues in milk and dairy UPLC-MS-MS determination of the method.The method uses electrospray ionization,multiple reaction monitoring in negative ion mode of chloramphenicol residues in qualitative and quantitative.The detection limit of the method milk 0.05 μg/kg,powder as 0.1 μg/kg,0.4～30.0 μg/L within the linear range of the regression equation was y=798.97+ 1874.56x,r=0.9993,the recovery rate 74.5%to 95.7%,relative standard deviation of 4.6%to 10.3%.The method is simple and convenient sample handling,high sensitivity,short analysis time,etc.,to meet the milk and dairy products-Determination of chloramphenicol residues.

UPLC-MS-MS；chloramphenicol；residual

TS252.7

A

1001-2230（2012）07-0050-03

2012-05-05

鞏軍（1963-），男，高級工程師，從事食品質量安全與檢測技術研究。

姜金斗