我國凝乳酶產生菌育種的研究進展

張超壘，王成忠，張志國,2,張玲梅

（1.山東輕工業學院食品與生物工程學院,濟南 250353；2.南京農業大學食品科技學院,南京 210095；3.山東龍大植物油有限公司，山東聊城 252000）

我國凝乳酶產生菌育種的研究進展

張超壘1，王成忠1，張志國1,2,張玲梅3

（1.山東輕工業學院食品與生物工程學院,濟南 250353；2.南京農業大學食品科技學院,南京 210095；3.山東龍大植物油有限公司，山東聊城 252000）

綜述了目前我國在凝乳酶產生菌在自然選育、誘變育種和基因工程育種這3方面的研究進展情況。

微生物凝乳酶；自然選育；誘變育種；基因工程育種

0 引言

隨著人們生活水平的提高及生活觀念的轉變，奶酪生產行業得到了很快的發展，與之相關的凝乳酶生產行業也發生了很大的變化：到目前為止，在酶制劑行業，凝乳酶已躍居成為世界第二酶制劑[1]；生產凝乳酶的方法也從小牛皺胃提取法發展到了植物組織提取法和微生物發酵生產法。利用微生物生產凝乳酶，發酵周期短、產量大及成本較低，在酶制劑生產行業得到廣泛認同，與此同時凝乳酶產生菌育種的研究也日漸興起。

1 凝乳酶簡介

1.1 凝乳酶及其分類

凝乳酶是一種能使牛乳凝固的酶。傳統意義上的凝乳酶是小牛皺胃酶，它以前體的形式合成，經過剪切形成具有323個氨基酸殘基的活性凝乳酶分子，等電點為4.2，分子量為40 500 u。小牛皺胃酶，具有酸性蛋白酶家族的類二折疊對稱的特點，分子可分為由1～175氨基酸殘基組成的N端區域和由176～323氨基酸殘基組成的C端區域，在N端區域和C端區域的分離裂溝底部發現兩個天冬氨基酸活性位點，Asp-34和Asp-216。凝乳酶分子中，氨基酸殘基和水分子在活性位點形成廣泛的氫鍵網狀結構以維持凝乳酶的類二折疊對稱結構；二硫鍵Cys-250和Cys-283，對酶的活性有重要影響[2]。

根據凝乳酶的來源，可把凝乳酶分為動物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。動物凝乳酶，可從牛、豬和羊的胃中獲取：劉文宗等[3]發現乳豬胃酶具有凝乳性；張富新等[4]通過實驗證實羔羊皺胃酶也有較低的凝乳性。許多植物蛋白酶能使牛乳凝固，張富新等[4]利用木瓜蛋白酶和無花果蛋白酶與小牛皺胃酶和羔羊皺胃酶制得了較理想的干酪；紀麗蓮等[5]發現牛乳中添加5%生姜蛋白酶粗提物，60℃保溫4 min可使牛乳凝固；張寒冰等[6]用姜汁和胃蛋白酶混合制作了各項指標都較好的干酪。微生物凝乳酶的研究始于自20世紀50年代末,主要在美國、日本、西德、丹麥等國進行，所用菌種主要有栗疫菌、毛霉、微小毛霉和蠟狀芽胞桿菌等[7]；自1964年Arima發現Mucor pusillus可產生高活力凝乳酶以來，已有許多科學家發現產凝乳酶的新菌種，到目前為止，發現的產凝乳酶微生物達40余種[8]。

1.2 凝乳酶的凝乳機制

牛乳在凝乳酶作用下凝固，是由酪蛋白變化而引起的。牛乳中酪蛋白可分為αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。在酪蛋白膠體中，它們對于Ca2+的敏感程度不同，αs-酪蛋白易受Ca2+的影響而沉淀；在室溫以上并有Ca2+存在時，β-酪蛋白也形成沉淀；而κ-酪蛋白不僅本身穩定，且還具有抑制αs-酪蛋白及β-酪蛋白在Ca2+影響下沉淀的保護作用。牛乳中酪蛋白酸鈣-磷酸鈣復合體膠粒能保持相對穩定的膠體懸浮液狀態是與κ-酪蛋白的膠體保護作用是密切相關的。凝乳酶的凝乳過程可分為兩步：第一步，凝乳酶專一性水解乳中κ-酪蛋白的敏感鍵Phe105-Met106鍵，使其生成副κ-酪蛋白和糖巨肽；第二步，當總κ-酪蛋白被水解掉約85%時，生成的副κ-酪蛋白在Ca2+的存在下引起凝固，而對Ca2+穩定性差的αs-酪蛋白及β-酪蛋白，喪失了酪蛋白的膠體保護作用，隨副κ-酪蛋白聚集，形成凝膠體系。凝膠形成網絡，凝膠中的水分通過脫水收縮排出[7]。

2 微生物育種的方法

微生物育種，指培育優良微生物的生物技術，它是提高產品產量和質量的一條有效途徑，通常可分為自然選育和人工育種兩大類。

2.1 自然選育

自然選育是指對自然界中的微生物，在未經人工誘變或雜交處理的情況下進行分離和純化，然后進行純培養和測定，選擇優良的菌株進行保藏。自然選育簡單易行，可達到純化菌種，防止菌種退化，提高產量的目的，但在自然條件下基因發生突變的幾率特別低，所以選育效果不是很理想[9]。自然選育沿用多年，至今仍是工業微生物育種的手段之一。

2.2 人工育種

誘變育種是利用物理或化學因素處理均勻分布的微生物細胞群，在促進其突變率顯著提高的基礎上，采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數符合目的的突變株，以獲得供科學實驗和生產實踐使用的理想突變菌株[10]，它是發酵工業中的提供優良高產菌株的經典方法。代謝控制育種是在誘變育種的基礎上，獲得各種解除或繞過了微生物正常代謝的突變株，人為地使有用產物選擇性地大量生成累計，并且在有控制的條件下培養，大量地生產這種有用產物[11]，它打破了微生物調節的控制機制，將有用的代謝產物得到大量積累。雜交育種是在誘變育種基礎上利用兩個或多個遺傳性狀差異較大的菌株，通過有性雜交、準性雜交、原生質體融合和遺傳轉化等方式，而導致其菌株間的基因的重組，把親代的優良性狀集中在后代中的一種育種技術[9]。基因工程育種是在基因水平上，運用人為方法將所需供體生物的某一遺傳物質提取出來，離體條件下用適當工具酶進行切割后，與載體連接,然后導入另一細胞，使外源遺傳物質在受體細胞中進行正常復制和表達，是當前最先進的育種技術[12]。

3 我國凝乳酶產生菌的育種

3.1 自然選育

自然選育凝乳酶產生菌，運用常規純培養技術對自然條件下的微生物進行分離純化，再進行篩選得到產凝乳酶的優良菌種。雖然自然條件下基因發生突變的幾率很低，選育優良菌株的可能性不大，我國學者仍然在此方面做了很多有益的嘗試。郭光遠等[13]在對云南不同地區的湖泊采集土樣、湖底泥和水樣，進行分離純化，得到2502株放線菌、真菌、細菌進行了凝乳酶產生菌的篩選，結果發現放線菌中鏈霉菌屬（Streptomyces）、小單胞菌屬（Micromonospora）、馬杜拉放線菌屬（Actinomadura）等和9.8%的真菌及8.8%的細菌中都有一定的凝乳酶酶活力。劉振民等[14]從酒藥中篩選出一株凝乳酶高產菌株,并對其進行產酶條件研究,結果表明:土豆汁培養基是適宜產凝乳酶培養基,培養基起始pH值為6.43～6.51,培養時間為59～64 h,培養溫度為34～35℃,該菌株的凝乳酶活可以達到80 SU/mL。蔣詠梅等[15]從104份土樣中分離到一株產豆凝乳酶的芽孢桿菌(Bacillus sp.)。孫健等[16]從17株產凝乳酶的霉菌中初篩到產酶量較高的總狀毛霉(Mucorracemosus)菌株。李子木等[17]從14種酒曲中分離純化出了18株菌株,其中8個具有凝乳酶活力，采用酪蛋白平板法和Arima時間法篩選出了1株產生凝乳酶能力強的菌株。宋曦等[18]從天祝放牧牦牛生活環境土壤中分離出一株產凝乳酶細菌，并對其進行了鑒定，為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，其在麩皮培養基中發酵72 h產凝乳酶活力高達89.56 SU/mL，蛋白水解力為21.27 U/mL。吳進菊等[19]從中國曲中篩選出一株凝乳酶高產菌株Rhizopus arrhizus F34，研究得出該菌株產酶的最佳發酵培養基為：米粉麩皮水解液4.5%，黃豆粉水解液4.0%，CaCl20.3%，KCl 0.5%；最佳培養條件為：初始pH 4.5，培養60 h，此時凝乳酶活力可達161.14 SU/mL凝乳酶活力與蛋白酶活力比值為27.88。范素琴[20]從紅曲米中篩選出一株凝乳酶產生菌，研究顯示馬鈴薯葡萄糖培養基是該菌最佳培養基,正交試驗得出該菌最佳培養條件為：溫度30℃,轉速為160 r/min,振蕩培養72 h,此條件下凝乳酶活力可達150.6 SU/mL。

3.2 誘變育種

誘變育種，根據所用的誘變劑不同可分為物理誘變育種和化學誘變育種。常用的物理誘變劑為輻射中的各種射線，包括紫外線、X-射線、γ-射線、快中子、α-射線和宇宙線等；化學誘變劑是一類能對DNA起作用、改變其結構、并引起遺傳變異的化學物質，包括堿基類似物、烷化劑、脫氨劑、金屬鹽類及其他化學誘變劑[11]。誘變育種具有一定的盲目性，但仍是微生物育種最基礎的育種手段。對于凝乳酶產生菌的誘變育種，我國學者進行了大膽的探索，獲得了具有應用價值的優良菌種。孫健等[16]以初篩得到的一株產酶量較高的總狀毛霉為出發菌株，對其進行了不同劑量60Co照射，篩選到一株變異菌株R132，凝乳活力提高了80%。郭光遠等[13]選定一株毛霉(Mucor sp.)代號Y85-8512和一株芽孢桿菌(Bacillus sp.)代號Y85-8501作出發菌，經誘變育種，得到凝乳活力分別可達到5 000 SU/g和10 000 S U/g的穩定高產菌株。蔣詠梅等[15]以從土壤中篩選到的一株芽孢桿菌(Bacillus sp.)為出發菌株，先進行紫外照射，后經硫酸二已酯處理，誘變獲得一株凝乳酶高產菌株，對其優化培養基組成成分，凝乳酶活力提高5倍以上。邵淑娟等[21]對產凝乳酶的黑曲霉進行微波輻照，酪蛋白培養基凝乳圈初篩，基礎培養基固態發酵復篩，誘變選育出遺傳穩定的突變株WB6-3、WB2-5，凝乳活力分別比出發菌株提高了35%和14%。

3.3 基因工程育種

基因工程育種往往是先得到目的基因，然后選擇載體，準備載體并與目的基因連接成重組DNA，轉化、轉導或轉染受體細胞，最后是利用遺傳標記和分子生物方法等篩選具有表達目的基因功能的重組體，從而構建具有特殊功能的基因工程菌。基因工程育種則實現了微生物選育的理性化，人們運用此手段可以定向地孕育新的微生物菌種。在基因工程育種凝乳酶產生菌方面,我國在對表達載體以及啟動子的篩選方面做了研究[22]。王志林等[23]通過設計一對特異性的引物,采用RT-PCR方法從未成熟的木瓜組織中擴增得到木瓜凝乳酶基因,并將其重組到pPIC9K載體中,轉化大腸桿菌并篩選陽性克隆,選育出了攜帶木瓜凝乳酶基因大腸桿菌。張渝英等[24]應用含有tac啟動子和牛凝乳酶B基因的表達質粒pTaAC進行了構建，并轉化到大腸桿菌JM105中，凝乳酶原基因的表達受溫度和加入的IPTG誘導劑所調控，活性酶產量達到14～20 mg/L。王革等[25]研究表明核糖體結合位點（RBS）的二級結構在原核生物中是決定翻譯起始的一個關鍵因素,為了避免使用價格昂貴的誘導劑IPTG及進一步提高牛凝乳酶原基因表達水平,采用PRPL啟動子取代Tac啟動子，構建一套帶有trp啟動子的表達質粒，通過變異翻譯起始區段，可使大腸桿菌表達凝乳酶達到總細胞蛋白的39%。張莉等[26]從小牛皺胃中提取凝乳酶(Chymosin)總RNA,經過RT-PCR獲得凝乳酶cDNA,純化后與pMD-18T載體連接,轉化大腸桿菌JM109,通過雙酶切和序列測定,獲得了凝乳酶全長基因序列，將其克隆到原核表達載體pET-22b中,構建重組質粒pET-22b/Chymosin，為凝乳酶的進一步表達奠定了基礎。孫大慶等[27]從克隆載體pS19-PPC中獲得牛凝乳酶原基因,將該基因與表達載體pNZ8148連接，轉化乳酸乳球菌NZ9000,轉化子經酶切、PCR和測序鑒定后,用nisin進行誘導表達,表達產物純化后檢測，其凝乳活性可達2×103mL-1（國際凝乳酶活數）。姜媛媛等[28]將克隆到微小毛霉凝乳酶基因，插入原核表達載體pTWlN1中，使之與幾丁質結合域(CBD)一內含肽(intein)融合，獲得原核表達質粒pTWIN1/M，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得了重組蛋白。

4 展望

隨著經濟全球化進程的加速，奶酪的營養價值得到了人們的認同，在奶酪制造工藝成熟和其潛在消費市場巨大的前提下，我們需要優良凝乳酶產生菌用于凝乳酶制劑的生產。在選育凝乳酶產生菌方面，我們要做好以下工作：（1）篩選更多的優良菌種來生產凝乳酶；（2）利用傳統誘變選育凝乳酶高產菌株，用于凝乳酶制劑的工業化生產；（3）獲得非正常代謝的突變株，人為使凝乳酶選擇性地大量生成累積，并且在有控制的條件下培養，大量地生產凝乳酶；（4）在誘變育種基礎上利用兩個或多個遺傳性狀差異較大的菌株，通過有性雜交、準性雜交、原生質體融合和遺傳轉化等方式，把親代的優良性狀集中在產凝乳酶菌株上；（5）尋找更好的載體、宿主細胞和啟動子，不斷提高凝乳酶在受體細胞中的表達率效率。相信伴隨著微生物育種技術的進步和凝乳酶需求量的劇增，凝乳酶產生菌的育種會在我國得到很好的發展。

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Rearch advancement of the strain breeding which can produce chymosin in China

ZHANG Chao-lei1，WANG Cheng-zhong1，ZHANG Zhi-guo1,2，ZHANG Ling-mei3
(1.College of Food Engineering and Biotechnology,Shandong Institute of Light Industry,Jinan 250353,China;2.College of Food Science and technology，Nanjing Aragricultural University,Nanjing 210095,China;Shandong LongDa Plant Oil Co.,Ltd.,Liaocheng 252000，China)

.In terms of natural screening,mutation breeding and the breeding of gene engineering,this paper reviewed the rearch advancement of the strain breeding which can produce chymosin in China.

microbial chymosin；natural screening；mutation breeding；the breeding of gene engineering

Q935

B

1001-2230（2011）04-0036-03

2010-09-29

張超壘（1983-），男，碩士研究生,研究方向為食品資源開發。

王成忠