微小果核上人體脫落細胞DNA檢驗

鄭紹軍,李 靜,曾 麗,趙彩云

(廣安市公安局刑事科學技術研究所,四川 廣安 638000)

微小果核上人體脫落細胞DNA檢驗

鄭紹軍,李 靜,曾 麗,趙彩云

(廣安市公安局刑事科學技術研究所,四川 廣安 638000)

本文作者結合實際檢案工作對微小果核上微量脫落細胞采用直接剝離果核種皮、剪碎、浸泡、反復多倍純水稀釋、震蕩、離心收集脫落細胞,通過固液分離、超純水清洗、離心等手段消除一些PCR的抑制因素,采用Chelex法聯合Q IAGEN試劑盒聯合提取純化濃縮DNA模板,適當增加PCR循環數,明顯提高了微小果核上微量脫落細胞的檢出成功率。

法醫物證學;微小果核物證;DNA檢驗;微量脫落細胞

在現代犯罪行為中,現場物證呈現出多樣化、微量化的發展趨勢。在筆者接觸的多起殺人、盜竊案件中,果核均成為案發現場提取的唯一生物檢材。微量生物檢材上粘附的脫落細胞數量有限,使得現場的PCR抑制因素更加突出,因此在提取微量生物檢材上脫落細胞時應盡量多收集,至少達到足夠一次PCR的細胞量。目前提取果核上脫落細胞常采用雙棉簽法或絲線擦拭法。該方法主要是針對體積較大的果核,對桔子、柚子核等微小果核提取效果較差。筆者結合一例入室搶劫殺人案介紹微小果核上人體脫落細胞DNA檢驗。

1 案例資料

2009年12月,四川某縣江某(男,78歲)被殺死在自己家中。在死者家2樓及3樓堆放的油菜稈中提取桔子核及皮若干。實驗室受理后,將剝下的桔子核種皮剪碎、浸泡、反復多倍純水稀釋、震蕩、離心收集脫落細胞,采用chelex法聯合Q IAGEN試劑盒提取檢驗,獲得完整DNA圖譜。經比對分析,桔子核種皮上脫落細胞DNA分型與嫌疑人一致。

2 試劑及儀器設備

試劑:5%Chelex-100(5g 200-400目的Chelex-100 100ml超純水)、PK10mg/ml、Q IAGEN試劑盒、Sinofiler復合擴增試劑盒。

儀器:3130型基因分析儀、9700型PCR擴增儀。

3 檢材情況

所送現場提取得桔子核共7粒,外表較干燥,不同程度粘附有柴草、灰塵、沙礫。

3.1 DNA提取:方法1:取2粒桔子核,用干棉簽輕輕拭掉上面的灰塵、草屑,然后先用適度濕潤的紗線用力擦拭果核表面一遍,再用干紗線再用力擦拭一遍。將兩次擦拭紗線置于1.5mlEP管內,采用《GA/T383-2002法庭科學DNA實驗室檢驗規范》中chelex法處理,加入80ul chelex-100,并加入10mg/mlPK,使之終濃度達到200ug/ml,56℃消化60分鐘以上,100℃煮沸8分鐘;震蕩后13000rpm離心5分鐘,4℃保存備用。

方法2:取2粒桔子核,用干棉簽輕輕拭掉上面的灰塵、草屑,剝除桔子核種皮,剪碎,置入1.5mlEP管內,純水1000ul浸泡15分鐘以上,期間吹打并高速震蕩,13000r/min離心5分鐘,去上清。再次加入純水1000ul稀釋高速震蕩,13000rpm離心5分鐘,重復該操作3-5次。采用chelex法處理,加入80ul chelex-100,并加入10mg/mlPK,使之終濃度達到200ug/ml,56℃消化60分鐘以上,100℃煮沸8分鐘;震蕩后13000rpm離心5分鐘,4℃保存備用。

方法3:取2粒桔子核,處理方法同方法2。取chelex法處理后的DNA上清液(全部吸盡,盡量不要吸到珠子),使用Q IAGEN試劑盒中的PB I溶液按體積比5∶1充分混勻,以13000rpm離心過柱子,棄掉下層液體,重復此操作直到混合液全部濾過,加已配無水乙醇的PE洗滌液500ul,離心洗滌1次,將65℃預熱的EB洗脫液30ul直接加到純化柱的硅膜上,13000rpm離心2分鐘,4℃保存備用。

3.2 PCR擴增與檢測:分別取以上三種方法得到的模板DNA,采用10ul擴增反應體系,其中Reaction Mix 1.0ul,Gold Tag酶0.3ul,Primer set 1.0ul,模板DNA 1.0ul、1.75ul、2.5ul梯度擴增,用超純水補足體系。根據Sinofiler復合擴增試劑盒說明書設置,置于9700型PCR擴增儀擴增。

擴增產物經3130型基因分析儀電泳收集信息,用GeneMapper ID v3.3進行等位基因分析。

3.3 結論:按照方法1處理桔子核未能得到STR基因座分型圖譜,按照方法2處理桔子核未能得到全位點STR基因座分型圖譜(圖一),按照方法3處理桔子核檢出全部STR基因座分型(圖二)。

4 討 論

4.1 檢材的收集:從載體上提取人體脫落細胞DNA的含量合純度,受個體差異、與載體接觸時間、載體性質等諸多因素的影響[1]。桔子核屬于微小果核,果核上脫落細胞量較少,用棉簽或紗線擦拭往往不能得到足夠量的DNA模板,為此筆者采用將果核種皮剝離剪碎浸泡以收集足夠量的脫落細胞,但因受果膠、果酸的影響,剛開始浸泡液十分粘稠,其比重大于細胞,故直接離心不能使脫落細胞沉淀,需要反復多倍純水稀釋震蕩離心。這是收集脫落細胞的關鍵。

4.2 檢材DNA提取:Chelex法提取微量生物檢材上細胞DNA的優點是操作方便,步驟簡單,整個提取過程在一個離心管中完成,減少了污染的機會,但是單用Chelex法提取缺點也十分明顯,即不能濃縮純化DNA,尤其對微量生物檢材提取成功率低,如上述方法1、2,均未能得到滿意的DNA STR分型。筆者先采用Chelex法提取微量檢材DNA,既可以提取到較多量的模板DNA,又可通過固液分離、超純水清洗、離心等手段初步消除一些PCR的抑制因素,在Chelex法提取基礎上加用Q IAGEN試劑盒往往成功檢出微量檢材DNA STR分型。

4.3 擴增反應及檢測:在提取咬過的水果、吃過的果核時,因受果膠、果酸的影響,可以用chelex-100配合Q IAGEN試劑盒提取,建議用25μL全體系擴增,擴增時適當增加2-4個循環,循環數不要超過32個,否則會出現非特異性擴增或漏擴增,影響結果判定。對微量DNA進行分析,由于DNA含量少,且受載體介質影響,結果產生不對稱擴增、等位基因丟失或增加等問題,甚至被污染,所以要結合比對對象,確定結果是否可采用,無比對對象檢材要進行重復試驗,基因型相同時才可確定[2]。

4.4 質量控制:嚴格防范在現場勘查或送檢過程中的檢材污染[3],盡可能將相關人員的DNA數據放入質控庫。嚴格執行《法庭科學DNA檢驗規范操作標準》(GA/T383-2002),避免試驗室內污染。實驗中必須設置陽性對照、陰性對照及試劑對照,以保證檢驗結果準確性。

[1] 郭燕霞,陳 松,劉開會,等.人體脫落上皮細胞DNA檢驗2例[J].刑事技術,2007,(1):51-52

[2] 陳 松,李萬水,胡 蘭,等.微量DNA:容易忽略的生物物證[J].刑事技術,2004,(1):19-21

[3] 胡 蘭.法醫遺傳學進展與應用[M].北京:群眾出版社,2008.29-32

1005-3697(2011)03-0260-02

DF795.4

B

2011-04-22

(學術編輯:杜 冰)