種間對比研究方法闡明解耦聯蛋白與最大壽命的關系

王春明 鄭榮梁 (蘭州大學生命科學學院生物物理研究所,甘肅 蘭州 730000)

活性氧作為氧自由基及其衍生物是體內最常見的自由基類物質,發揮著重要的生物作用。體內生成活性氧的源頭是線粒體,線粒體活性氧產率與動物最大壽命負相關,線粒體解耦聯蛋白 (uncoupling protein,UCP)能降低線粒體活性氧產率。因此,UCP很可能具有延緩衰老的作用,且可能是壽命的決定性因素。目前,探索 UCP與壽命關系的研究雖然很多,但結果相互矛盾。因此,本文擬提出應用種間對比研究方法闡明這一問題。

1 線粒體活性氧產率與動物最大壽命負相關

對比研究為衰老的自由基理論提供了重要證據,線粒體活性氧產率與最大壽命負相關的研究主要有：①5種蠅胸飛行肌線粒體活性氧產率與其壽命負相關〔1〕;②哺乳動物肝、腎和心肌線粒體活性氧產率與其最大壽命負相關〔2,3〕;③鳥類壽命遠高于鼠,其線粒體活性氧產率遠低于鼠〔4,5〕;④親緣關系較近的兩種小鼠M.m usculus和 P.leucopus,者壽命僅是后者的一半,短壽鼠線粒體超氧陰離子自由基 (O2)和 H2O2產率分別比高壽鼠多 48%～74%和 300%～500%〔6〕。

對比研究還解決了衰老的代謝率理論所不能解釋的矛盾現象。衰老的代謝率理論一直在衰老研究領域占有重要地位,認為壽命與代謝率呈負相關。但有些動物壽命不符合這個學說。比如小鼠M.m usculus的代謝率低于 P.leucopus,但是前者壽命反而小于后者〔6〕;鳥類和靈長類的壽命都遠高于依據其代謝率推斷的預期值〔7〕。例如：鴿的代謝率為 465 L O2/g,遠高于大鼠 28 L O2/g,但鴿的壽命 (35年)卻遠長于大鼠 (4年)〔8〕。而衰老的自由基理論根據線粒體自由基產率這個指標完滿地解釋了上述現象。對比研究發現,若用單位耗氧量生成自由基及其衍生物的量來衡量(常以線粒體產生 H2O2作為廣義的自由基的代表),消耗同樣多的氧,鴿線粒體產生的 H2O2僅為大鼠的 1/10,這正好對應了鴿的壽命約為大鼠壽命 10倍的現象〔4〕?？梢?不論種內,還是種間對比研究,都表明線粒體自由基產率與壽命負相關。Barja曾對這類對比研究的結果有過比較系統的總結〔9〕。莫斯科國立大學的 Skulachev教授曾于 2004年在 Aging Cell雜志發表文章,專門討論了 Barja等人的鳥鼠對比研究成果〔10〕。

但是,同樣是線粒體,為什么它們的活性氧產率如此不同呢?針對這一問題,Lass等曾報道 9種哺乳動物 (小鼠、大鼠、豚鼠、兔、豬、山羊、綿羊、牛和馬)心肌線粒體生成 O·-2的量與其所含輔酶 Q(CoQ)同族體 CoQ9含量正相關,與 CoQ10量負相關,但是他們同時卻發現并不能把不同哺乳動物線粒體 O·-2產量的差異歸因于 CoQ9和 CoQ10量的不同〔11〕;后續研究還發現,補充 CoQ10也并不能增強動物抗氧化能力及延長壽命〔12〕。因此,CoQ是否能合理地解決前述問題尚需更多證據。可見,自由基理論在線粒體及其產生的活性氧水平上似乎完滿地解釋了決定衰老和壽命的根本原因,然而其更深層次的機制,即到底是什么決定了線粒體在活性氧產率方面存在如此大的差異,卻依然有待深入探索。近年來,新的線粒體內膜 UCP同源蛋白的發現讓人們看到了解決這一問題的曙光。

2 UCP降低線粒體自由基產率

UCP是一類位于線粒體內膜的跨膜蛋白。哺乳動物共含有 5種同源蛋白,它們是 UCP1～UCP5〔13,14〕。這 5種 UCP在動物體內的分布和表達具有組織特異性。UCP1存在于褐色脂肪組織;UCP2的分布最為廣泛,其 mRNA表達水平在不同器官中差異較大,例如脾臟中 UCP2表達很高,而肝臟中較低;UCP3主要存在于骨骼肌和心肌中;UCP4和 UCP5主要在大腦中〔13～16〕。近年來 ,在線蟲、果蠅、魚類、鳥類、爬行類甚至植物中也相繼發現了哺乳動物 UCP的同源蛋白〔13,14,17,18〕。

UCP1在褐色脂肪組織中負責非寒戰性產熱,對冬眠動物和新生兒體溫維持起重要作用〔15,16〕。其他 4種 UCP,盡管它們的基因序列與 UCP1相比同源性很高,同屬于 UCP家族,但其生理功能尚無定論。它們都具有使呼吸鏈質子回流,使氧化磷酸化輕微解耦聯,進而降低線粒體自由基生成的作用。UCP的這一功能恰恰受到了自由基的激活〔19〕,即 UCP對線粒體自由基的生成具有反饋性抑制作用。2008年,Nature雜志報道胃內產生的生長素釋放肽 ghrelin對神經元發揮作用的機制就在于UCP2降低了自由基的產生〔20〕。2009年 Jiang等發現 UCP在運動過程中表達升高,可能起到保護運動造成的氧化脅迫對線粒體的損傷作用〔21〕。

UCP降低線粒體自由基產率的工作原理見圖1：呼吸鏈的電子傳遞在線粒體內膜兩側建立了跨膜質子梯度 (trans-membrane proton gradient,△pH)和線粒體膜電位 (mitochondrial membrane potential,△Ψm),△pH和 △Ψm的升高,促進了 O·-2的生成;而 UCP可以把質子從膜間隙流入基質,從而使△pH和△Ψm降低,使氧化磷酸化輕微解耦聯,降低自由基的生成。也可以這樣形象地理解：UCP是一個巧妙的設計,它就像大自然安裝在線粒體內膜的安全閥一樣,當線粒體產生過多自由基而具有危害時,UCP就被激活而降低自由基的生成,從而減少氧化性損傷。

圖1 解耦聯蛋白降低線粒體自由基生成示意圖

3 UCP與壽命關系研究的現狀和困境

線粒體是正常生理條件下細胞內自由基的主要來源,由它產生的自由基對細胞損傷的積累導致了衰老,并影響壽命的長短〔22〕。UCP既然從源頭上調控著自由基的產生,其對衰老和壽命的影響就是本質性的。從這個意義上來說,UCP可能是決定壽命的原初分子。

UCP與壽命關系的研究才剛剛起步〔23,24〕。2005年,Fridell等報道把人UCP2基因轉入果蠅的神經系統后,果蠅壽命延長了 10%～30%〔25〕;他們隨后把果蠅體內 DmUCP5基因敲除后,在食用低熱量食物情況下,比野生型果蠅的壽命還要長,而在食用高熱量食物時則無差別〔26〕。前一個研究發現 UCP有利于壽命的延長,但是第二個研究卻發現 UCP基因的敲除卻并沒有使果蠅壽命縮短。這表明敲除果蠅整體的 DmUCP5基因對果蠅壽命的影響比只在神經系統中過表達 UCP2基因更復雜。更有甚者,Humphrey等 2009年報道把人 UCP3基因 (hUCP3)分別轉入果蠅整體、泛神經元以及神經分泌細胞〔27〕。結果發現,果蠅整體低表達 hUCP3對線粒體的質子內流無影響,在泛神經元中高表達 hUCP3則增加了質子內流,在神經元內的中度表達可使雄性果蠅壽命稍微延長,但是在神經組織中的高表達卻造成果蠅壽命的縮短。分析發現,人為的基因表達對轉基因果蠅造成的影響是多方面的,神經組織高表達 hUCP3的結果造成了胰島素樣多肽水平的升高,這可能與壽命的縮短相關聯。這一研究結果也告誡人們,試圖應用基因操作方法通過高表達UCP在增大質子內流的同時,造成的影響可能會是多方面的,不一定會得到延長壽命的預期結果。因此,在研究 UCP與壽命的關系時,基因操作的方法并不適用。線蟲實驗也發現,敲除 CeUCP-4基因后并沒有影響到線蟲的抗氧化能力和壽命〔28〕。這個結果似乎也不支持 UCP與壽命之間存在聯系。但是,2009年 Lemire等人用線粒體解耦聯劑氰氯苯腙 (CCCP)卻證實線粒體的解耦聯作用可以延長線蟲的壽命〔29〕。因此,前述 CeUCP-4基因敲除不影響線蟲壽命的報道很可能是基因敲除方法影響了線蟲其他基因表達而造成的。這也進一步證明了基因操作方法在UCP與壽命關系研究中的局限性。2006年12月第一篇應用基因操作手段研究 UCP與哺乳動物壽命的文獻發表在 Science上〔30〕,作者用轉基因的方法使小鼠下丘腦神經元細胞過表達 UCP2,導致轉基因鼠體溫下降,最終延長了實驗動物的壽命。這一工作為UCP2能夠調控高等生物體壽命提供了直接證據。2009年Andrews等詳細報道了UCP2調控小鼠壽命的現象〔31〕。他們發現,UCP2的缺失使野生型小鼠壽命縮短,而且 UCP2表達水平與線粒體特有的超氧化物歧化酶(SOD-2)突變小鼠的存活率正相關。因此認為 UCP2有助于壽命的延長,進一步證實了小鼠 UCP2對其壽命的重要作用。特別值得一提的是,他們同時報道了大鼠不同組織的線粒體解耦聯能力強于小鼠的現象,似乎預示了大鼠壽命高于小鼠。這說明同行中已經有人注意到了對比研究方法在 UCP與壽命關系研究中的潛在作用。

以上實驗在肯定UCP2延長壽命作用的同時,也反映出所用實驗方法存在的缺陷。在所用的 3類動物模型 (果蠅、線蟲、小鼠)中,果蠅和小鼠特定神經元過表達 UCP可延長壽命〔25,30〕,但果蠅整體過表達或某些組織過表達 UCP的結果卻很復雜〔27〕,而果蠅和線蟲中敲除內源 UCP基因卻不影響壽命〔26,28〕。這一方面說明 UCP過表達的效果具有組織特異性,也說明 UCP敲除的影響有可能被其他機制所補償,比如,UCP缺失造成的對活性氧調節功能的損害,可通過其他抗氧化機制得到補償;還有可能是基因操作方法本身影響到了其他基因的功能,最終掩蓋了 UCP基因敲除對壽命的影響。不僅如此,基因操作方法在研究哺乳動物壽命方面存在難以彌補的缺陷。例如,小鼠壽命較短,用基因操作的方法來研究尚需幾年時間,對于更長壽命的哺乳動物用基因操作的方法研究壽命就更難了。因此,種間對比研究在不干擾實驗動物遺傳背景的前提下,更適合闡明哺乳動物UCP與壽命的關系。

4 種間對比研究方法應用于UCP與壽命關系研究

種間對比研究已經揭示了線粒體活性氧產率與最大壽命負相關的規律,推測 UCP與壽命有關的觀點也正是基于這一規律。我們通過對金絲雀和小鼠心肌線粒體的對比研究,發現前者 UCP活性及蛋白表達水平分別是后者的 3倍和 4倍,基本與金絲雀心肌線粒體自由基產率低的現象相一致〔32〕。這一結果對于種間對比研究方法應用于 UCP與壽命關系研究提供了很好的支持。

總之,衰老是一個長期復雜的過程,是受多因素影響和決定的。對UCP功能的深入研究有利于揭開衰老和壽命的部分奧秘。

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