益生菌豆乳發酵劑的篩選

包艷，蘇芳，董喜梅，姚國強，王水泉，張和平

（1.內蒙古農業大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018；2.包頭醫學院 公共衛生學院，內蒙古包頭 014030）

益生菌豆乳發酵劑的篩選

包艷1,2，蘇芳1，董喜梅1，姚國強1，王水泉1，張和平1

（1.內蒙古農業大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018；2.包頭醫學院 公共衛生學院，內蒙古包頭 014030）

為生產出具有良好風味和感官特性的發酵豆乳，選用Lactobacillus plantarum IMAU10156和L.IMAU60042分別與Lacbobacillus acidophilum S21-1，Streptococcus thermophilus S21-2，Bifidobacterium animalis L01-1復合發酵豆乳,接種量分別為1×107mL-1，于42℃發酵和4℃貯藏期間測定菌落總數、pH值、滴定酸度、黏度及脫水收縮性指標，并在貯藏1 d進行感官鑒評。結果表明，L.plantarum IMAU10156與S.thermophilus S21-2，L.plantarum IMAU60042與S.thermophilus S21-2復合具有良好的發酵特性，在6 h即可到達發酵終點，發酵豆乳產品具有純正的豆乳發酵香味、酸甜適口、組織狀態良好等特點，是兩組具有開發價值的益生菌豆乳發酵劑。

發酵豆乳；益生菌；發酵特性

0 引 言

發酵豆乳（Fermented soymilk）是利用微生物的發酵作用制成的一種發酵豆制品。微生物發酵可分解大豆中的抗營養因子和消除豆腥味，使豆乳變成更易于消化吸收和營養美味的食品[1,2]，同時使大豆異黃酮轉化為活性形式[3-5]，而且還會產生多種功能性多肽如降血壓活性肽等[6]。尤其使用益生菌發酵劑發酵豆乳會使產品兼具一種或多種益生特性，增添了產品的營養保健功效。

本研究選用的L.plantarum IMAU10156和L.plan-tarum IMAU60042是我實驗室從102株分離自自然發酵乳制品及酸粥中的植物乳桿菌中篩選出來的2株具有潛在益生特性的植物乳桿菌，具有較好的耐酸、耐膽鹽、人工胃腸液、凝集和抑制常見胃腸道致病菌的特性。以2株植物乳桿菌分別與嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌相搭配復合發酵豆乳，對其發酵特性進行評價，為進一步研究開發出具有良好風味和感官的發酵豆乳提供了基礎數據。

1 實 驗

1.1 菌株與材料

本實驗所使用的L.plantarum IMAU10156、L.plantarum IMAU60042、L.acidophilum S21-1、S.thermophilus S21-2、B.animalis L01-1均由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供。

MRS（Man Rogosa Sharpe broth）液體、固體培養基，BBL液體、固體培養基配方及材料也由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供。

大豆為市售黑龍江大豆。

1.2 儀器設備

NSC-II A-1200型無菌工作臺，HITACHI U-2000型分光光度計，HIRAYAMA HA-300MIII型全自動高壓滅菌器，ADVANTEC SP-650型全自動干熱滅菌器，BACKMAN GS-15型離心機，雷磁pHSJ-3F型pH計，STAC-S45F恒溫培養箱，FDM-Z 125-60型漿渣自動分離磨漿機，SRH 60-70型高壓均質機，BROOKFIELD DV-E型黏度計等。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化及及菌粉的制備

將冷凍干燥保存的菌種L.plantarum IMAU10156、L.plantarum IMAU60042、S.thermophilus S21-2、L.acidophilum S21-1接種于MRS液體培養基中，置37℃培養18～22 h，傳代培養2次。

將冷凍干燥保存的菌種B.animalis L01-1接種于BBL液體培養基中，置37℃厭氧培養18～22 h，傳代培養2次。

分別取上述菌種培養液5 mL，經3,500×g離心10 min，收集菌體，加入5 mL滅菌生理鹽水洗滌兩次后，混勻制成供試菌懸液，待真空冷凍干燥后菌粉備用。

1.3.2 不同混合菌株在豆乳中發酵特性

將大豆稱量后用自來水清洗3～4次，用水溫90℃熱水浸泡4 min，再用0.35%的NaHCO3溶液浸泡2 h，瀝干泡豆的水，再清洗3～4次，將大豆與50～55℃的溫水按1︰6的比例磨漿。豆渣中加入適量的溫開水（50～55℃），充分攪拌后，再磨濾2次，3次所得的漿液混勻即成全漿，加水補足，制成豆水比為1∶7的豆漿。用120目的篩子過濾，除去豆渣，將豆漿連續煮沸3次。添加質量濃度為65 g/L蔗糖，過濾，15～25MPa下二次均質。經95℃（15 min）殺菌后，冷卻至42℃左右接種，接種量分別為1×107mL-1，混勻，分裝于已滅菌100 mL燒杯中，42℃恒溫培養，每隔3 h取樣測定其菌落總數、pH值、滴定酸度、黏度及脫水收縮性指標（平行實驗重復3次，取平均值）。以pH值降到4.5為發酵終點，將樣品轉入4℃冰箱貯藏1 d，取樣測定上述指標并進行感官鑒評[7，8]。

1.3.3 微生物指標的檢測

將發酵樣品用滅菌PBS梯度稀釋至一定倍數后，采用平板傾注法，37℃培養 （包括含有雙歧桿菌的需要厭氧）24～48 h計菌落總數，測定各菌株活菌數[9]。

1.3.4 理化指標檢測

pH值采用精密pH計測量。

滴定酸度測定：取發酵豆乳9 g，加入10 mL的蒸餾水，混勻，加入2滴酚酞作指示劑，用標準濃度為0.1 mol/L的NaOH滴定。滴定酸度為100 mL發酵豆乳消耗濃度為0.1 mol/L的NaOH的毫升數。消耗1 mL濃度為0.1 mol/L的NaOH相當于1°T[8]。

黏度測定：將發酵乳樣品調溫至20～22℃，采用Brookfield DV-1 VISCOMETER黏度儀4#轉子進行測定，其中轉子轉速為100 r/min，扭矩為10%～100%，測定時間為30 s。

脫水收縮性測定：稱取15.0 g發酵豆乳樣品，置于帶有濾紙的漏斗中，室溫放置90 min，收集濾液并稱重[8,10]。脫水收縮性=（濾液質量/樣品質量）×100%。

1.3.5 凝固型發酵豆乳的感官鑒評

由5名女性5名男性共10名學生組成感官鑒評小組，并接受感官鑒評培訓。小組成員要求對發酵豆乳的表觀、氣味、風味和質地指標進行評價[8,11]。

表觀指標——乳清析出、表面粗糙、黏聚性（保形能力）；

質地指標——剖面細膩度、硬度、稠度、拉絲性、平滑性；

氣味指標——豆香味、酸味、臭味、蒸煮味、豆腥味；

風味指標——豆香味、豆腥味、酸甜比、苦味、異味、油膩性、澀味。

發酵豆乳的感官鑒評指標如上所述，感官鑒評得分采用100分制。

1.3.6 數據分析

實驗數據采用SAS 9.0軟件的ANOVA和CORR程序進行方差分析和相關性統計分析，采用Origin 7.0軟件做圖。

2 結果與討論

2.1 凝乳時間

分 別 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1、S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1復合發酵豆乳，各組發酵豆乳凝乳和發酵時間測定結果如表1所示。

表1 各組復合發酵豆乳凝乳和發酵時間

由表1可以看出，發酵豆乳的凝乳時間越長則所需的發酵時間越長。各組復合發酵豆乳中凝乳和發酵時間最短的是L.plantarum IMAU10156和L.plantarum IMAU60042分別與S.thermophilus S21-2復配，凝乳時間僅為3 h，而發酵6 h即可到達發酵終點；凝乳和發酵時間最長的是L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1復配，用時為7 h和15 h。可以發現，豆乳對于嗜熱鏈球菌來講是非常好的營養基質，能夠使其快速的發酵產酸，雙歧桿菌利用豆乳的效率為其次，而利用率最低的是嗜酸乳桿菌。在研究開發益生菌發酵劑時可以考慮添加嗜熱鏈球菌或者雙歧桿菌來加快發酵速度。

2.2 發酵和貯藏過程中活菌數的變化

分 別 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1，S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1復合發酵豆乳，不同發酵和貯藏時間活菌數測定結果如表2所示。

由表2可以看出，發酵結束后，各組復合發酵豆乳中益生菌L.plantarum IMAU10156與L.plantarum IMAU60042的活菌數在7.9～9.0 mL-1（對數值），在貯藏過程中，L.plantarum活菌數變化不顯著（P＞0.05），基本趨于穩定。但對于產品4℃長期貯藏仍能否保持較高的活菌數，以符合歐盟規定益生菌產品在其貨架期內益生菌活菌數至少保持在106cfu/g以上的要求[12]，我們仍需要實施延長貯藏時間的實驗。研究中我們還發現，即使是同一菌屬的不同菌株之間存在著某些性質的菌株特異性，繼而導致雖分別與同一菌株搭配復合發酵豆乳時發酵特性的不同。

2.3 發酵和貯藏過程中的pH值變化

分 別 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1，S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1復合發酵豆乳，不同發酵和貯藏時間pH值測定結果如表3所示。

由表3可以看出，發酵過程中各菌株發酵豆乳的pH值顯著下降（P＜0.05）。其中，S.thermophilus S21-2與兩株植物乳桿菌復合發酵在6 h即可到達發酵終點，pH值下降速率約為0.40 h-1；L.plantarum IMAU60042與B.animalis L01-1復合發酵7 h到達終點，pH值下降速率約為0.35 h-1；而L.plantarum IMAU10156與L.acidophilum S21-1復配、IMAU10156與B.animalis L01-1和L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1的復合發酵均較耗時約為10～15 h，導致pH值下降速率僅為0.16～0.24 h-1。顯然，前3組發酵豆乳所用時間短，對于工業生產在節約動力和能源，以及保證產品質量方面都有非常大的優勢。這主要是由于嗜熱鏈球菌能夠很快的利用豆乳中的糖迅速增殖，生成乳酸致使pH值快速下降的結果。貯藏1 d后，各復合發酵豆乳組pH值變化趨緩。這可能是由于，發酵過程使乳酸生成量增加，pH值下降，從而使豆乳由中性轉變為酸性，而酸性環境又使菌體的增殖受到抑制，乳酸的生成速度下降，同時限制了pH值的進一步降低，如此使得pH值在貯藏期間保持了相對的穩定性。

2.4 發酵和貯藏過程中的滴定酸度變化

分 別 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1，S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1復合發酵豆乳，不同發酵和貯藏時間TA測定結果如表4所示。

滴定酸度反應了包括肽段和游離氨基酸殘基在內的所有酸性基團的總和。由表4可知，發酵過程中各復合發酵豆乳的滴定酸度顯著升高（P＜0.05），并且儲藏1 d的過程中仍然會繼續升高。其中L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1復合發酵豆乳的滴定酸度顯著高于其余5組（P＜0.05），而其余5組間變化值無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 各組復和發酵豆乳中活菌數隨發酵和貯藏時間變化（對數值）mL-1

表3 各組復合發酵豆乳pH值隨發酵和貯藏時間變化

2.5 發酵及貯藏過程中的黏度變化

分 別 以L.plantarum IMAU10156、L.plantarum IMAU60042與L.acidophilum S21-1、S.thermophilus S21-2、B.animalis L01-1復合發酵豆乳，不同發酵和貯藏時間黏度測定結果如表5所示。

由表5可以看出，發酵過程中各組發酵豆乳的黏度均顯著升高 （P＜0.05）；L.plantarum IMAU10156和L.plantarum IMAU60042分別與S.thermophilus S21-2復配、L.plantarum IMAU60042與B.animalis L01-1復配發酵豆乳的黏度在發酵3 h時顯著高于其余3個組（P＜0.05），但是在發酵結束和貯藏1 d時，各組黏度無顯著性差異（P＞0.05）。這可能是由于，菌體增殖導致發酵豆乳中乳酸的含量增加，當達到足夠濃度時，大豆蛋白凝固形成酸凝膠，使黏度迅速增加，菌體代謝受到抑制，乳酸的生成速度下降，限制了黏度繼續上升，從而使發酵豆乳黏度保持相對穩定[13]。

許多研究表明，很多的S.thermophilus菌株可以產生胞外多糖，可以使酸奶樣品具有良好的拉絲性或比較黏稠的質地[14，15]。本研究結果雖證實了菌株S.thermophilus S21-2對產品質地方面的積極影響，但是尚不能確定是否由于其產生胞外多糖所致。

2.6 發酵及貯藏過程中的脫水收縮敏感性變化

分 別 以L.plantarum IMAU10156，L.plantarum I MAU60042與L.acidophilum S21-1，S.thermophilus S21-2，B.animalis L01-1復合發酵豆乳，發酵結束及貯藏1 d的持水力測定結果如表6所示。

由表6可以看出，發酵結束和貯藏1 d的脫水收縮性最低的是2株植物乳桿菌分別與S.thermophilus S21-2復合發酵豆乳產品（P＜0.05），而脫水收縮性最高的是2株植物乳桿菌分別與B.animalis L01-1復合發酵豆乳。并且各組發酵豆乳的脫水收縮性貯藏1 d后比剛剛發酵結束時均有所降低。發酵產品的脫水收縮性越低，說明其產品的持水性越好，發酵豆乳凝膠體系中束縛水的含量就越多，在不破乳的情況下更能保持產品較好的風味和氣味，使產品口感更佳，對于凝固型發酵豆乳是一個很大的優點。

2.7 發酵豆乳感官鑒評結果

益生菌的添加有助于提高發酵產品的感官品質[16]，本研究中應用2株具有潛在益生特性的植物乳桿菌分別與L.acidophilum S21-1、S.thermophilus S21-2、B.animalis L01-1復合制備發酵豆乳，制得產品的感官鑒評平均分值均在60～90分之間（圖1），尤其是2株植物乳桿菌與S.thermophilus S21-2復合發酵豆乳產品，表觀、質構、氣味和風味顯著高于其余4組（P＜0.05），發酵產品無乳清析出，表面細膩，黏聚性、剖面細膩度、硬度、稠度、拉絲性及平滑性顯著優于其他發酵產品 （P＜0.05）；有明顯豆香味，無臭味、蒸煮味和豆腥味；酸甜表5各組復合發酵豆乳黏度隨發酵和貯藏時間變化/（Pa·s）比例適中，具有悅人的豆香味，無苦味、異味和澀味，不油膩。得分最低的為L.plantarum IMAU60042與B.animalis L01-1，主要原因是在產品的風味和氣味上不及其余5組。

表4 各組復合發酵豆乳TA隨發酵和貯藏時間變化/oT

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表6 各組復合發酵豆乳在發酵結束及貯藏1 d的脫水收縮性

圖1中，A組為L.plantarum IMAU10156+L.acidophilum S21-1；B組為L.plantarum IMAU10156+S.thermophilus S21-2；C組為L.plantarum IMAU10156+B.animalis L01-1；D組為L.plantarum IMAU60042+L.acidophilum S21-1；E組為L.plantarum IMAU60042+S.thermophilus S21-2；F組 為L.plantarum IMAU60042+B.animalis L01-1；角標含不同字母的數據之間差異顯著（P＜0.05）。

3 結 論

（1）發酵試驗中，2株具有潛在益生特性的植物乳桿菌分別與S.thermophilus S21-2復和發酵豆乳，凝乳時間為3 h，發酵時間為6 h；各組復合發酵豆乳中益生菌L.plantarum IMAU10156與L.plantarum IMAU60042的活菌數在7.9～9.0 mL-1（對數值）， 貯藏過程1 d，L.plantarum活菌數變化不顯著（P＞0.05）；發酵期間pH值下降速率和滴定酸度上升速率顯著高于其他組合（P＜0.05）。黏度與其他組結果無顯著性差異（P＞0.05）。

（2）對各組產品進行感官鑒評，其中2株植物乳桿菌與S.thermophilus S21-2復合發酵豆乳產品，表觀、質構、氣味和風味顯著高于其他組（P＜0.05），發酵產品無乳清析出，表面細膩，黏聚性、剖面細膩度、硬度、稠度、拉絲性及平滑性顯著優于其他組（P＜0.05）；有明顯豆香味，無臭味、蒸煮味和豆腥味；酸甜比例適中，具有悅人的豆香味，無苦味、異味和澀味，不油膩。

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Screening of probiotic strain of soymilk fermentation starter culture

BAO Yan1,2，SU Fang1，DONG Xi-mei1，YAO Guo-qiang1，WANG Shui-quan1，ZHANG He-ping1
（1.Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering Ministry of Education,Dairy Processing Laboratory of Na tional Dairy production technology and Research Center,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018 China；2.Public health college,Medical College of Baotou,Baotou 014030,China）

To produce fermented soy milk with favorable taste and sensory properties,L.plantarum IMAU10156 and L.plantarum IMAU60042 was repectively combined with L.acidophilum S21-1,S.thermophilus S21-2,B.animalis L01-1 for soy milk fermnetation.The initial inoculation were 1×107cfu/mL and then subjected to fermentation at 42℃followed with a 4℃storage for evaluation of viable counts,pH value,TA,viscosity,syneresis and sensory assessment（1d storage）.The results showed that fermented soy milk in the L.plantarum IMAU10156 and S.thermophilus S21-2,L.plantarum IMAU60042 and S.thermophilus S21-2 group was of better fermented characteristic and pleasing aroma of beans,moderate sweet and great appearance plus with 6h short fermentation time,indicating that it is a promising potential starter cuture for probiotic soy milk fermentation.

fermented soymilk；Probiotics；fermentation properties

TS252.54

A

1001-2230（2011）08-0011-05

2011-05-09

國家科技支撐計劃（2009BADC1B01）；現代農業產業技術體系建設專項資金資助。

包艷（1977-）,女,博士研究生,從事益生菌方面的研究。

張和平