西瓜雜交種子純度鑒定方法研究進展

摘要：西瓜雜交種子純度鑒定一直是個技術難題，是雜交種子生產經營的重要環節。文章綜述了利用傳統的田間種植鑒定西瓜雜交種子純度的方法，以及電泳技術和分子標記技術等實驗室技術手段在西瓜雜交種子純度快速鑒定應用方面的研究進展及存在的問題。

關鍵詞：西瓜；雜交種子；純度鑒定

西瓜是世界十大水果之一，我國西瓜栽培面積及產量均居世界首位，而優質的西瓜種子特別是雜交良種是各種類型西瓜栽培成功的前提。自20世紀80年代西瓜雜交一代品種在我國普及推廣以來，栽培面積迅速擴大，但在人工制種過程中，由于隔離不嚴或人工去雄不及時、不徹底等原因而導致雜交一代種子不純，因而給生產造成了損失。所以，加強對西瓜雜交一代種子純度快速鑒定方法的研究，已成為西瓜良種生產中的一個重要環節。

當前種子生產和經營部門對西瓜種子純度的檢測主要靠田間種植的方法。近年來，隨著生化及分子技術的發展以及在作物品種鑒定上的應用，國內外一些科研單位開展了利用蛋白質電泳技術以及DNA分子標記技術在西瓜雜交種子鑒定上的應用研究，旨在探索一種準確、經濟、快速的實驗室鑒定方法。

1 形態檢驗法在西瓜種子檢測上的應用

傳統的種子鑒定主要采用種子形態鑒定、苗期標記形態鑒定、子房形態鑒定及果實形態鑒定等是目前西瓜品種純度鑒定的主要方法。

1.1種子形態鑒定法

除三倍體無籽西瓜外，一般雙親二倍體雜交一代西瓜種子形態與母本相同或相近，可根據母本種子的大小、色澤、形狀及種子表面裂紋、麻點的有無及多少判斷。三倍體無籽西瓜可從種子形態上進行純度鑒定，其母本為四倍體，種子種胚發育好，種子飽滿，種面較凸：三倍體雜交種子種胚發育不好，種子較癟，種面平或凹入。該鑒定法在收種后可在室內鑒定，鑒定周期最短，成本最低，一般只有三倍體無籽西瓜品種種子適于該法鑒定，但無法將母本相同父本不同的2個無籽西瓜品種區別開。

1.2苗期形態鑒定法

指從出苗至開花前的發育階段進行形態鑒定。進行苗期鑒定的品種，與母本相比必須有一些明顯的標記性狀和特征。如葉形(全緣葉、缺裂葉等)，以全緣葉作母本、缺裂葉作父本的，表現缺裂葉的為雜交株，全緣葉的為假雜株，在幼苗3～4片葉時即能準確識別，鑒定周期為30～40d，利用該性狀育成的西瓜品種有津豐1號等：葉片后綠性狀，后綠與一般正常綠幼苗或植株都有明顯的區別，苗期鑒定以子葉出土到幼苗長出第1片葉最適宜，鑒別期為7～10d，應用的西瓜品種有鄭果5506等。此外，該鑒定方法可利用的標記性狀還有幼果皮色、蔓形(短蔓、緊湊等)、葉色(葉片黃斑等)、花蕾形狀、葉蔓光滑無毛、蔓無分枝等。但該鑒定法技術難度大，不易掌握。

1.3子房形態鑒定法

該法利用瓜胎或幼瓜等標記性狀鑒定，從播種到瓜胎顯現為1個鑒定周期，需40-50d，是目前西瓜雜交種鑒定最常用的方法。不同類型子房的西瓜雜交組合其F₁代的子房形狀有區別，一般圓×長的雜交組合如西農8號類型，F₁代子房表現短橢圓形，圓子房為假雜株。長×圓的組合如豐收2號類型，F₁代子房為短橢圓形、中部肥大，假雜株為長橢圓形。圓×圓的組合如京欣1號類型，F₁代子房為高圓形，假雜株為圓形。該鑒定法優點是鑒定周期較短，占地較少，鑒定成本較低：缺點是不能看出果形或皮色與雜交父本相似的其他自由交雜種植株，對鑒定地域的積溫條件要求較高。

1.4果實鑒定法

果實膨大后可從果面特征及剖面進行鑒定。果面特征可從顏色深淺，外觀形狀，網紋或花皮，條帶的寬與窄、規則與鋸齒，有無果粉等特征進行區分；果實成熟后剖瓤看籽，根據種子大小、形狀、顏色以及瓜瓤顏色鑒別其純度：無籽西瓜還可以看是否有種子以及空殼、秕籽的多少進行鑒別。該法是西瓜品種特征最明顯、結果最可靠的鑒定方法，但周期長，占地多，費用大，對鑒定地域的積溫條件要求高。多用于仲裁鑒定、親本鑒定以及雜交種與雙親外觀差別不明顯的鑒定。

2 蛋白質電泳技術在西瓜種子檢測上的應用

蛋白質電泳主要是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，通過分析作為基因產物的蛋白質和同工酶來鑒定品種純度。該法包括同工酶電泳法和種子貯藏蛋白質電泳法，2種方法在西瓜種子純度鑒定上都有報道。

2.1同工酶電泳法鑒定

黃永紅等㈣對6個西瓜雜交組合進行了過氧化物同工酶純度鑒定研究。結果表明，利用苗期過氧化物同工酶可以進行西瓜雜交種真實性與純度鑒定。陳清華等對無籽西瓜組合G₁、雜交西瓜組合G₂及其雙親不同生長期、不同部位的過氧化物酶、酯酶同工酶進行研究的結果表明，G₁母本胚根、第1真葉的過氧化物酶同工酶，胚芽、子葉及第2、第3真葉的酯酶同工酶酶譜明顯異于子代：G₂母本的胚芽、子葉及第2真葉的酯酶同工酶酶譜明顯異于子代。馬國斌㈣對西瓜雜交種西農8號和無籽西瓜黑蜜2號及其父母本苗期子葉的3種同工酶進行了分析。結果顯示，過氧化物酶同工酶多態性較高，且該同工酶活性高，活性不易喪失，染色也較簡單，在西瓜雜交種純度鑒定中具有很好的適用性。

但有關西瓜雜種純度鑒定電泳技術的報道各研究結果出入很大。鄭秋素等發現，在酯酶、過氧化物酶與多酚氧化酶的同工酶檢驗中，西瓜雜交組合與雙親間的酶帶僅存在深淺上的差異。張興平等㈣對西瓜的10個雜種及其16個親本的過氧化物酶同工酶和酯酶同工酶進行了分析。結果表明，西瓜雜種與其親本在同工酶表現上的關系很復雜，若受檢的西瓜品種間沒有足夠大的遺傳差異，則其種子的過氧化物酶、酯酶的差異很小或無差異。柳李旺等研究認為，西瓜是遺傳變異度較小的作物，位點多態性較低，同工酶蛋白質電泳難以用于F₁代雜種純度檢測與品種鑒定。曹宛紅等的研究結果表明，過氧化物酶同工酶僅在某些西瓜品種間表現出差異，而對于像京欣1號這種父母本親緣關系很近的雜交種，4種同工酶系統及可溶性蛋白檢驗技術均不可能有效地進行純度鑒定。朱立武等研究了西瓜4個雜交組合種子及其萌芽期過氧化物酶同工酶譜特征。結果表明，4個雜交一代種子萌芽期幼苗過氧化物酶同工酶譜表現為無差別、母本型等，無法鑒定雜種。

2.2種子蛋白質電泳法鑒定

黃為平等㈣研究表明，利用種子水溶蛋白等電聚焦丙烯酰胺電泳的方法，可以鑒定京欣l號，京抗2號、3號雜交種子純度。王璽等㈣利用種子蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳等多種電泳技術對西瓜雜交種進行了純度鑒定，結果表明干種子蛋白質聚丙烯酰胺凝膠電泳法在一定條件下，可將供試西瓜雜交種與其親本種子明顯區分開。李麗等對京欣1號、金花寶2個雜交種的研究顯示，在種子蛋白質SDS—PAGE電泳圖譜中找到一代雜種與父母本的鑒別帶能進行雜交種純度鑒定。王景升等研究表明，4種同工酶譜帶的穩定性和品種間的特異性均以酯酶同工酶最強，適于用做品種鑒定，但都無法將供試的13份試材區分開，只有蛋白質電泳譜帶可以將其區分開。萬云龍等分析了西瓜雜交種蘇蜜5號、早抗京欣和抗病蘇蜜及其父母本種子的酯酶、過氧化物酶、多酚氧化酶及種子蛋白。結果顯示，蛋白質和同工酶難以發現統一的譜帶特征來檢測不同西瓜雜交種子的純度。

3 分子標記技術在西瓜種子檢測中的應用

分子標記技術是通過直接分析遺傳物質(DNA)的多態性來比較基因組的結構與組成，通過鑒定DNA水平上的差異來鑒別品種。目前，在西瓜種子純度鑒定中主要應用的DNA分子標記技術有擴增片段長度多態性(amplifiedfragmentlengthpolvmorphism，AFLP)技術、隨即擴增多態性DNA標記(ran—domamplifiedpolymorDhicDNA，RAPD)技術、簡單重復序列(simplesequencerepeats，SSR)技術和相關序列擴增多態性(sequence-relatedamplifedpolymor—ohism，SRAP)技術等。

車克鵬等利用高效可靠的AFLP技術對逾30個西瓜材料進行研究并建立了DNA指紋圖譜，利用圖譜可以有效地區分不同西瓜材料。劉文革等對西瓜二倍體及同源多倍體的遺傳差異進行AFLP分析，結果表明大部分引物組合擴增出的不同倍性西瓜之間的AFLP譜帶無明顯差異，表明不同倍性西瓜間的多態性很低。前人對西瓜進行多態性分析，結果表明西瓜品種間同源性較高，遺傳基礎狹窄，多數品種親緣關系較近。

歐陽新星等對京欣1號及其父母本篩選了320個RAPD引物，得到1個引物可以區分母本和雜交種，但不能區分父本和雜交種，同時對42份國內外西瓜種質材料進行了RAPD分析，從600個隨機引物中篩選10多個重復性好、能產生多態性的引物，找到了某些特殊的RAPD譜帶，但效果不太明顯。王鳴剛等以不同西瓜雜交種及親本自交系為材料，研究利用RAPD技術鑒定西瓜雜種的純度及種質的方法。結果表明，在反應條件適合、引物選擇正確的情況下，RAPD技術完全適合于西瓜雜交種純度的早期鑒定，閆鵬等選用100條隨機引物對西瓜甜瓜雜種一代和其父母本的種子進行RAPD分析。結果表明，在100條引物中篩選出了4條有特征條帶的引物能進行西瓜雜交種的純度鑒定。日本的Hashizume等用RAPD技術成功鑒定了西瓜雜交種Fiiihikari的純度。

艾呈祥等以2個西瓜雜交品種(系)的種子及其親本為材料用SSR標記鑒別真假雜種，結果發現多數SSR引物對自交系的擴增只出現1條條帶，但部分引物在某些自交系中擴增出2條條帶，所測純度與田間純度非常接近，表明SSR標記可應用于西瓜雜交種子純度鑒定。田雷等以4個西瓜雜交種和8個親本為試驗材料，篩選出了能夠區分4個雜交種與雙親，并具有互補帶型的SSR引物，建立了適于SSR分子標記檢測西瓜種子品種純度的反應體系。試驗結果證明，這套檢測技術體系可用于西瓜雜交種品種純度室內快速鑒定。

劉澤發等采用SRAP技術，成功篩選出1對多態性好的引物對E2M5，對二倍體小果型西瓜品種紅小玉雜交種純度開展了分子鑒定研究。試驗結果表明，E2M5引物對在紅小玉雜交種和親本間擴增出品種特異性條帶，適合在室內快速準確地進行雜交種的純度鑒定，試驗結果與大田鑒定結果吻合率高。

4 研究展望

形態學種植觀察、蛋白質電泳分析和DNA分子標記等不同方法均可實現對西瓜雜交種子純度的鑒定。形態學鑒定具有直觀、技術容易掌握等優點，但易受環境影響，結果不夠準確，田間種植鑒定周期太長，費時費力，且不利于種子及時銷售。利用同工酶和蛋白質電泳圖譜鑒定具有靈敏度高、準確、易操作等優點，但同工酶位點及蛋白質種類有限，對親緣關系很近的雜交種難以區分，且沒有一種大家公認可靠的西瓜種子蛋白質或同工酶的電泳譜帶可用來進行西瓜品種的純度鑒定。RAPD技術與其他分子標記方法比較具有簡單、快速的優點，尤其是在鑒定大量個體的雜種或品種純度方面具有優勢，應用RAPD分子標記技術進行雜交種純度的鑒定已有許多報道，只要能通過技術上的改進提高試驗的重復性，就能使該技術應用于生產；SSR技術，以PCR為基礎，具有信息含量高，呈共顯性遺傳，易于分析，重復性、穩定性高等特點，非常適合用于雜交種品種純度的鑒定。SRAP標記特異性和可重復性較高，利用該技術進行種子純度鑒定具有方法簡單、可靠的特點，可以廣泛應用于西、甜瓜種子純度鑒定。

隨著分子生物學的發展，直接在DNA水平上進行基因組差異分析的技術，愈來愈多地被用于作物品種鑒定的研究。因此，加強分子標記在鑒定西瓜種子純度上的應用研究，為西瓜種子質量的檢測提供準確、經濟、快速的室內種子純度鑒定體系十分必要。今后應加強開發以PCR技術為核心的SSR、SRAP、SCAR等分子標記引物，充分利用不同分子標記技術以加快遺傳圖譜的整合工作，完善高密度遺傳標記連鎖圖譜：同時在遺傳圖譜構建方面，積極開展SNP標記、EST標記等新型分子標記在西瓜上的研究應用。