節瓜基因組DNA提取方法比較研究

摘要：以節瓜的成熟干種子、子葉和不同發育階段的真葉為材料，選用尿素提取法、高鹽低pH值法、SDS法和CTAB法等4種DNA提取方法進行比較。結果表明：不同節瓜材料均可以提取到基因組DNA，其中子葉和第1片真葉的提取效果最好；尿素提取法提取種子DNA最為簡便快捷，CTAB法提取葉片能得到純度較高的基因組DNA。經PCR檢驗.干種子和子葉提取的基因組DNA都可用于PCR擴增。

關鍵詞：節瓜；基因組DNA；提取方法；干種子；子葉

節瓜(BenincasahispidaCogn.vat.Chieh-quaHow.)又稱毛瓜、毛節瓜，是葫蘆科冬瓜屬作物，是冬瓜變種.主要以幼嫩果實為產品器官.是我國華南地區主要蔬菜作物之一.在東南亞地區也廣泛栽培。

DNA提取是生物技術研究的基礎步驟。隨著節瓜生物技術研究的開展，建立不同組織、不同器官基因組DNA的快速高效提取方法十分必要。在植物DNA提取方法研究中.前人多選用真葉作為試驗材料.在節瓜上尚未見利用其他部分進行DNA提取的報道.在DNA提取方法中常用的有CTAB法、SDS法等.由于瓜類作物中含有較多的糖類和多酚類物質.很容易干擾PCR擴增效果，因此需針對具體的作物種類.探索高質量DNA提取方法。謝大森等比較了冬瓜葉片DNA提取方法，認為PVP法和CTAB-Free法提取冬瓜DNA質量高.但數量偏少：程志學等㈣基于CATB法.建立了適合擴增長度多態性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)分子標記技術的節瓜DNA提取方法。本研究在此基礎上.進一步對不同組織以及不同DNA提取方法的效果進行了比較.旨在建立節瓜基因組DNA的高效提取方法.為節瓜的相關分子生物學研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1材料

試驗材料為節瓜優良自交系LTlR、A06一A111，由廣東省農業科學院蔬菜研究所瓜類研究一室提供。取材部位分別為：(1)成熟的干種子；(2)展平的子葉；(3)第1片真葉；(4)成株(總節位30節左右，下同)上部幼嫩葉片(選取第25～29節位的葉片)；(5)成株中部葉片(選取第13-19節位的葉片)：(6)成株下部老葉(選取第3-9節位的葉片)。

1.2方法

本試驗采取4種方法提取節瓜基因組DNA.分別是尿素提取法、高鹽低pH值法、SDS法和CTAB法。

1.2.1 尿素提取法參照李菊芬等的方法.具體操作步驟如下：(1)單粒去殼的干種子以及0.05g子葉或真葉分別置于預冷研缽中.干種子可直接加600μL提取液(7mol·L^-1尿素.0.2mol·^-1Tris-HCloH值8.0.0.05mol·L^-1EDTA.2％十二烷基肌氨酸鈉)迅速研磨并轉入1.5mL離心管中：葉片需加入適量液氮迅速研磨成粉末狀.加入600μL提取液混勻并轉人1.5mL離心管中。(2)每管加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)劇烈振蕩.12000r·min^-1離心5min，取上清液(重復抽提1次)。(3)加入1／10體積NaAc(3mol·L^-1.pH值5.2)和等體積預冷異丙醇，輕輕混勻，12000r·inin^-1離心5min。(4)棄上清液。加入400IxLTE溶解沉淀。(5)加入1mL預冷無水乙醇.輕輕混勻，12000r·min^-1離心5min。(6)棄上清液，用預冷的75％乙醇洗滌沉淀1，2次.在超凈臺上吹干后加入適量ddH₂O將沉淀完全溶解。(7)加入5μLRNaseA(10g·L^-1)，37℃水浴40-60min.-20℃保存備用。

1.2.2高鹽低pH值法 參照王傳堂等、楊萍等的方法，部分改進，具體操作步驟如下：(1)樣品處理方法同上述尿素提取法.加600IxL提取液.其組分為NaAc(0.1mol·L^-1)，EDTA(50mmol·L^-1)，NaCl(0.5mol·L^-1)，2％PVP，1.4％SDS，0.5％β-巰基乙醇.最后將提取液的pH值調至5.5；(2)65℃水浴40min：(3)加入2／3體積的3mol·L～KAc，冰浴30min(4)12000r·min^-1離心10min.取上清液，加入等體積預冷異丙醇，-20℃放置15min；(5)12000r·min^-1離心10min.棄上清液.沉淀用75％預冷乙醇洗滌(用無水乙醇洗滌利于吹干).放置于超凈臺上吹干：(6)加入500IxLTE溶解沉淀，沉淀完全溶解后加入5μL(10g·L^-1)，37℃水浴30min：(7)加入等體積氯仿，12000r·min。離心10min；(8)取上清液，加入等體積預冷異丙醇，-20℃靜置20min：(9)12000r·min^-1離心10min，棄上清液.預冷無水乙醇洗滌沉淀.在超凈臺上吹干后加入適量ddH₂O將沉淀完全溶解.-20℃保存備用。

1.2.3SDS法 參照李菊芬等、杜道林等的方法，具體操作步驟如下：(1)干種子和葉片的處理方法同前，加600μL提取液.其組分為100mm01.L^-1Tris-HClpH值8.0，100mmol·L^-1。EDTAoH值8.0，0.5mol·L^-1NaCl，1.5％SDS；(2)65CIC水浴30min，12000r·min^-1離心10min：(3)取上清液.加入等體積酚：氯仿：異戊醇(25：24：1).混勻后12000r·min^-1離心10min，重復抽提1次；(4)取上清液，加人等體積預冷的異丙醇輕輕混勻.5000r·min^-1離心10min；(5)棄上清液，用無水乙醇洗滌沉淀2～3次，置于超凈臺上吹干；(6)將其溶于適量ddH₂O中，加入5μLRNaseA(10g·L^-1).37℃水浴40min，-20℃保存備用。

1.2.4CTAB法參考Porebski等的CTAB法并稍作改良，具體操作為：(1)用鑷子夾取0.05g左右的新鮮幼嫩葉片放人2mL離心管內。加人液氮.用研杵棒迅速將葉片研磨成粉末.加入1000μL事先預熱的2％CTAB抽提緩沖液(1mol·L^-1Tris-HCloH值8.0，0.5mol·L^-1EDTApH值8.0.1.4mol·L^-1NaCl，2％CTAB，1％PVP，1％β-巰基乙醇)I單粒去殼的干種子置于預冷研缽中加入1000μL抽提液研磨成漿，混勻后轉入2mL的eppendorf管內.置于65℃水浴中溫浴40-50min(期間不時搖勻)。(2)靜置至室溫下，12000r·min^-1離心10min.取上清液轉移到新的2mL離心管內。(3)加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，劇烈振蕩20s，靜置5min，4℃，12000r·min^-1離心10min.取上清液轉移到新的1.5mL離心管，重復抽提1次。(4)加入2／3體積預冷的異丙醇，輕晃.置于-20℃冰箱30min或者過夜。(5)4℃，12000r.min^-1離心10min，棄上清液。用75％乙醇洗滌DNA(2～3次).放在超凈工作臺上吹干。(6)向1.5mL離心管中加入200mL滅菌TE將DNA溶解，再加入5μl(10g·L^-1)，37℃水浴60min。(7)加入等體積預冷的氯仿：異戊醇(24：1)混勻，靜置10min，4℃，12000r.min^-1離心10min。(8)取上清液，加入1／10體積的NaAc(3moL·L^-1，pH值5.4)，2倍體積的預冷無水乙醇。20℃放置30min或更長時間(過夜沉淀DNA量多但可能會有雜質).4℃12000r·min^-1離心10min。(9)用無水乙醇洗滌DNA2次，在超凈工作臺上吹干。(10)加入適量的H₂O溶解DNA.-20℃保存備用。

2 結果與分析

2.1節瓜不同部位及不同生長時期材料對基因組DNA提取質量的影晌

本試驗采用CTAB法提取不同部位及不同生長時期的節瓜材料基因組DNA并進行了比較，經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，6種試驗材料均能提取到基因組DNA(圖1)，其中干種子、子葉和成株節瓜中、下節位葉片DNA的電泳條帶較暗，第1片真葉和成株節瓜上部節位嫩葉DNA的電泳譜帶較亮，表明幼嫩葉片的DNA含量比較豐富。從測得的OD₂₆₀／OD₂₆₀(表1)看，干種子的比值為1.73，說明殘存有少量的蛋白質：子葉和第1片真葉的比值最為理想，均在1.8-1.9：成株葉片的比值均在2.0以上，上部節位殘留的RNA也多。從干種子到成株的整個過程，基因組DNA提取的質和量各不同，從干種子中提取的量最少.上部節位葉片的最多：從子葉和第1片真葉中提取的質量最好。因此，綜合考慮，以節瓜子葉或第1片真葉為材料可獲得較為理想的基因組DNA。

2.2提取方法對節瓜種子與子葉基因組DNA提取質量的影響

2.2.1節瓜干種子 用4種不同的方法提取節瓜A06-A111干種子的基因組DNA.經1.2％瓊脂糖電泳檢測(圖2)顯示：用高鹽低pH值法提取的總DNA看不到條帶.說明提取量很少，用核酸蛋白儀檢測其濃度值也很低。其他3種方法OD₂₆₀／OD₂₆₀均在1.8左右.提取質量較好.尿素提取法和SDS法帶型一致.條帶也較亮，CTAB法提取的量少。在4種方法當中.尿素提取法所需時間最短，僅需要2h左右.步驟也相對簡單。因此，尿素提取法是一種快速、簡便適用于提取節瓜干種子基因組DNA的方法。

2.2.2節瓜子葉用4種不同的方法提取節瓜A06-A111子葉基因組DNA.經1.2％瓊脂糖電泳檢測(圖3)顯示：用高鹽低pH值法提取的基因組DNA同樣看不到條帶，說明提取量很少。尿素提取法條帶稍有拖尾，測其OD₂₆₀/OD₂₆₀為1.73，說明有蛋白質等雜質污染。SDS法條帶亮度明顯高于其他3種方法.說明DNA濃度相當大.但點樣孔附近殘留有蛋白等雜質，而且稍有拖尾現象。CTAB法提取的基因組DNA濃度較小，但所含雜質少、質量高，其OD₂₆₀／OD₂₆₀為1.81。4種提取方法各有利弊，因此，在應用當中應根據實際要求選擇最佳方法：如果對DNA純度要求不高.則SDS法和尿素提取法是較理想的方法：如果對DNA質量要求較高.則CTAB法是最佳選擇.而且可以通過適當加大提取樣品量解決提取基因組DNA量少的問題。

2.3PCR檢驗不同方法所提取節瓜基因組DNA的適用性

對于4種不同方法提取的基因組DNA.用RAMP引物擴增.檢驗其是否適用于分子標記。經2％瓊脂糖電泳檢測(圖4)顯示：用4種方法提取的基因組DNA均可用于RAMP-PCR擴增.且擴增帶型一致.表明直接從干種子和子葉當中提取的基因組DNA一樣，都可用于PCR擴增。

3 討論

提取高質量的基因組DNA是植物分子生物學研究的前提和基礎。建立利用不同部位、不同發育階段的試驗材料提取基因組DNA的有效方法對于進一步開展生物技術研究是非常必要的。目前有關節瓜、冬瓜DNA提取方法的報道均基于CTAB法.本研究比較了4種不同提取方法對DNA質量的影響，為節瓜基因組DNA提取提供了更多可選擇的方法。不同的分子技術手段和不同研究目的對模板DNA的質量要求也不盡相同。那些對模板DNA質量要求不高的分子技術方法.尿素提取法無疑是最佳選擇。對AFLP等分子技術方法.模板DNA的制備是非常重要的一個環節，模板DNA的質量直接關系著試驗的成敗。本試驗中CTAB法提取的DNA純度較高，完全可以滿足AFLP等方法的反應要求。因此針對不同的研究目的和分子技術手段.在實際應用過程當中要靈活選用不同的提取方法。

從不同部位不同器官不同發育階段的植物材料提取DNA對于拓寬植物材料取材范圍具有重要意義，特別是從干種子中提取基因組DNA不僅大大縮短了試驗周期.也可節約試驗成本.對于種子質量檢測等試驗操作非常必要。但種子中通常富含次生代謝產物，可能對DNA質量產生干擾。Kesari等的試驗結果表明，SDS法可以有效去除多糖、多酚及蛋白質，從錫蘭、麻風樹等木本油料作物干種子中提取高質量基因組DNA。本研究結果也表明.SDS法用于節瓜干種子DNA的提取效果較好。同時發現尿素法也是提取節瓜干種子DNA簡便快捷的方法。用SDS法和尿素法提取的基因組DNA均可用來進行PCR擴增。這一結果為簡便快捷提取節瓜基因組DNA提供了依據。

4 結論

以節瓜的成熟干種子、子葉和不同發育階段的真葉為材料進行基因組DNA提取.發現不同節瓜材料均可以提取到基因組DNA，其中子葉和第1片真葉的提取效果最好；對尿素提取法、高鹽低oH值法、SDS法和CTAB法等4種DNA提取方法進行了比較，結果表明尿素提取法提取種子DNA最為簡便快捷，CTAB法提取葉片則可以得到純度較高的基因組DNA。經PCR檢驗，干種子和子葉提取的基因組DNA都可用于PCR擴增。