電脈沖植物愈傷組織激活儀的研制及其應用

摘 要: 微電流處理可以加強或調節植物自身微電流的作用，從而促進植物培養組織的生長和分化。系統地介紹了電脈沖植物愈傷組織激活儀（專利號: ZL200720090104.1）研制的系統設計原理、硬件系統設計和軟件系統設計等情況。該儀器可用于植物生物技術相關領域的研究，處理的植物材料可以是細胞、花粉、葉片、葉柄、莖段或愈傷組織等外植體。

關鍵詞: 植物； 組織培養； 微電流儀；生長； 分化

中圖分類號：Q943．1 文獻標識碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1117－０5

Development and application of micro-electric current electro-enhancement instrument in tissue culture

WANG Bao-min， LI Ming，QIAO Xian-sheng，ZHAO Gai-rong，YU Hong，CUI Xue-chen，WANG He

（Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agriculture Sciences， Zhengzhou，Henan 450009 China）

Abastract: Micro-electric current could regulate and enhance the growth and differentiation of the plant cell， tissue and organ in vitro. The design principles， hardware and software system design， feature and technical parameters of the micro-electric current electro-enhancement instrument （patent number:ZL200720090104.1）are introduced in detail. It could be applied in plant biotechnology field. Plant materials include cell， pollen， leaf， petiole， stem or callus et al.

Key words: Plant； Tissue culture； Micro-electric current instrument； Growth； Differentiation

植物電生理是生命科學的一個重要研究領域，植物在整個生命活動進程中從個體、器官、組織、到細胞都伴有微電流的發生，生長越快，電流越強。外加微電流可以加強或調節植物自身微電流的作用，從而影響到植物培養組織的生長和分化。1985年，Rathore等[1-2]首先報道了微電流處理可以促進煙草愈傷組織的生長和芽的分化。微電流處理可以改變植物體內生長素的極性運輸和分布[3]，促進植物細胞的生長和分化，可能與微電流產生電位梯度引起細胞成分的重新分布有關。以后的研究發現，微電流還可以提高苜蓿胚狀體的發生率[4]，促進三葉草[5]和大豆屬、梨屬、茄屬等植物[6]原生質體的分裂，促進小麥[7]和石防風[8]原生質體形成細胞團，促進蘆筍小孢子胚性愈傷組織的形成[9]，促進百合葉片愈傷組織的形成和生長[10]。Colt原生質體懸浮液微電流處理后極為明顯地促進了以后的愈傷組織生長量和愈傷組織再生芽能力[11]。并且，微電流處理再生芽的生長速度和生長勢也要明顯地優于未處理對照的再生芽。此外，微電流處理增加細胞透性，改善植物激素的作用效能，因而再生芽的生根能力也被顯著促進提高了，表現在生根率、發根數量、根系生長量等方面。更進一步地研究發現，這種微電流處理效果可以在植物細胞內長期保存下去[12]。各種數據分析表明，微電流處理可能刺激、激活了那些與控制細胞生長和分化等有關的基因的有效表達。微電流處理有可能作為植物組織培養過程中調控植物生長發育的一條途徑，研究微電流對植物細胞的影響，對調控植物生長發育，具有重要的意義。為此，研制出電脈沖植物愈傷組織激活儀（專利號: ZL200720090104.1），可用于植物生物技術相關領域的研究，處理的植物材料可以是細胞、花粉、葉片、葉柄、莖段或愈傷組織等外植體類型。本文系統地介紹了該儀器研制的系統設計原理、硬件系統設計和軟件系統設計等情況，供相關領域的研究人員參考。

1 系統設計原理

電脈沖植物愈傷組織激活儀主要由機箱、電擊槽、單片機、高壓發生器、LED數碼顯示器等部分組成。該系統的工作原理: 將輸出到電擊槽上的脈沖電壓、脈沖持續時間、脈沖間隔時間、脈沖次數等參數調整到設定值，將要處理的植物樣品放入電擊槽內，加入適量緩沖液。當按動開始鍵時，有一預設脈寬和幅值的電脈沖輸出到達電擊槽，對相應的植物樣品進行激活處理。植物組織經過高壓電脈沖的適量刺激，使植物細胞在微電流的作用下出現短暫可逆性的開放小孔，激活了細胞內有關的酶系統，并激活了那些與控制細胞生長和分化等有關基因的有效表達，從而促進植物培養組織的生長和芽的分化。

2 硬件系統設計

2.1 硬件系統組成

電脈沖植物愈傷組織激活儀由面板（4）、電擊槽總成（7）、電路控制板等部分組成。面板（4）部分是由電壓調整鈕（1）、顯示窗（2）、按鍵（3）構成（圖1）。電擊槽總成（7）部分由槽體，固定電極（5），可調電極（6），高壓線，插槽等構成（圖2）。電路控制部分是由電擊槽電路（8）、電源（9）、高壓電脈沖發生器（10）、鍵盤（11）、單片機（12）、顯示器（13）、存儲器（14）等構成（圖3）。電路工作原理見圖4。

2.2 硬件電路設計

2.2.1 單片機 電脈沖植物愈傷組織激活儀的核心就是單片機，其性能對整個系統性能有重要影響。為此選定STC89C51RC單片機，該單片機具有超強抗干擾、高速、低功耗的特點，其指令系統與MCS-51完全兼容，12時鐘周期和6時鐘周期可以任意選擇，工作頻率范圍0～40 MHz，用戶應用程序空間4 K字節，片上集成512字節RAM，通用I/O口32個，ISP（在線可編程）/IAP（在應用可編程），看門狗，通用異步串行口（UART）。此單片機可使系統更加穩定可靠的工作。

2.2.2 高壓電脈沖發生器 高壓電脈沖發生器由振蕩源D、電壓調節電位器RP、功率推動模塊U7、升壓電路T等組成，通過調節電位器RP可使輸出的脈沖電壓幅度在0～1000 V。由單片機的P1.0端控制反相器U9_2、三極管VT4推動光電耦合器U8觸發高壓開關管VT2，輸出1～999 μs的電脈沖至電擊槽。

2.2.3 數據存儲器 數據存儲器由U2構成，用于保存脈沖電壓、脈沖持續時間、脈沖間隔時間、脈沖次數等參數。選用X5045數據存儲器，具有512字節串行E2PROM、看門狗、低電源電壓復位等特點。X5045的片選CS端和時鐘端SCK、數據輸入端SI、數據輸出端SO分別與單片機的P3.0～P3.3口相連，實現數據的傳送；X5045的復位端RST與單片機的復位端RST相連，實現了系統的開機復位和看門狗的喂狗復位，以防系統運行時出現死機。

2.2.4 顯示器 顯示電路由I/O擴展控制器U4（81C55）、8位反相緩沖器U5（74HC540）、8位同相緩沖器U6（74HC541）、7位LED數碼管和3位半數字電壓表M等電路組成。81C55的地址/數據線與單片機的P0口相連，74HC540用于位選、74HC541用于段選，其輸入端分別與81C55的A口、B口相連，輸出端分別與7位LED數碼管的位和段相連。7位LED數碼管用于顯示脈沖持續時間、脈沖間隔時間、脈沖次數，3位半數字電壓表M用以測定和顯示脈沖電壓。

2.2.5 鍵盤 5個按鍵由調位鍵K1、調數鍵K2、暫停鍵K3、停止鍵K4、開始鍵K5組成，和單片機的P1.1～P1.5口相連，用以調整各個參數和系統運行狀態。

2.2.6 電擊槽電路 電擊槽電路由高壓開關管VT2、高壓線、固定電極（5）和可調電極（6）等組成。高壓開關管VT2輸出的高壓線和地線分別連接至電擊槽總成的固定電極和可調電極，通過調整可調電極與固定電極之間的距離，可改變對兩電極之間的植物樣品所施高壓脈沖的強度。

2.2.7 聲音提示 聲音提示電路由反相器U9_1、U9_4、三極管VT1、VT5、單穩觸發電路U1和蜂鳴器B1、B2等電路組成。當每輸出一個電壓脈沖時，即觸發一次單穩電路使蜂鳴器B1發出一短促提示音。當脈沖次數顯示為“0”時，由蜂鳴器B2發出4次鳴笛提示音以示工作結束。

3 軟件系統設計

3.1 軟件主流程圖

電脈沖植物愈傷組織激活儀的軟件系統采用匯編語言設計，承擔電脈沖植物愈傷組織激活儀的脈沖電壓、脈沖持續時間、脈沖間隔時間、脈沖次數等參數的設定和控制，數據轉換、數據處理、界面顯示、鍵盤操作、聲音提示等功能。軟件主流程圖見圖5。

3.2 設定程序設計

開機系統初始化后首先檢測調位鍵K1是否按下，若調位鍵K1按下即進入設定程序。分別按動調位鍵K1、調數鍵K2，逐位輸入脈沖持續時間、脈沖間隔時間、脈沖次數等各項預設參數，并由U2等電路組成的存儲器將各項預設參數儲存起來，同時由U4、U5、U6、LED數碼管等電路組成的顯示器將各項預設參數顯示出來。部分設定程序如下:

SD:SETB TR0；開閃顯

MOV R1，#36H

MOV R0，#46H

MOV R5，#07H

SD1:LCALL CSX；傳數閃顯

JNB P1.1，SD1；調位鍵抬起？

SD2:LCALL CSX

JB P1.2，SD6；調數鍵按下？

；

SD8:DJNZ R5，SD9；各項參數設完？

SJMP SD10

；

LCALL page_write；將設定的各項參數寫入

串行E2PROM

；

SJMP YX；進入運行程序

3.3 運行程序設計

開機系統初始化后若調位鍵K1未按下即進入運行程序。首先將儲存在串行E2PROM中的脈沖持續時間、脈沖間隔時間、脈沖次數等各項預設參數調入內存并顯示。檢測開始鍵K5是否按下，若未按下則處于待機狀態；若開始鍵K5按下則判斷脈沖持續時間、脈沖間隔時間、脈沖次數各項參數倒計時后是否有一項為0。若不為0則啟動高壓電脈沖開關輸出一組有序的預設脈寬、間隔和次數的高壓電脈沖輸出到達電擊槽，對相應的植物樣品進行激活處理。脈沖次數和脈沖間隔時間均開始倒計時顯示，并且每輸出一次脈沖，均由蜂鳴器發出一鳴笛提示音。按動暫停鍵時，可使脈沖輸出暫停，脈沖次數和脈沖間隔時間顯示數字亦固定在當時值。當再次按動開始鍵時又繼續工作，直至脈沖次數顯示為“0”時，由蜂鳴器發出4次鳴笛提示音以示工作結束。在工作過程中，可根據需要隨時按動停止鍵停止工作。部分運行程序如下:

YX:CLR TR0

MOV DPTR，#0000H

MOV R1，#46H

MOV R2，#07H

LCALL sequ_read；將保存在串行E2PROM

中的各項參數讀出

；

YX1:JNB P1.1，SDZ ；調位鍵按下？

LCALL DIR；顯示

JB P1.5，YX1；開始鍵按下？

MOV A，46H

JNZ YX2；脈沖持續時間為0？

MOV A，45H

JNZ YX2 ；脈沖間隔時間為0？

MOV A，44H

JNZ YX2 ；脈沖次數為0？

SJMP YX1

；

SETB TR1

CLR P1.0；放電

YX5:JNB TF1，YX5 ；脈沖持續時間到?

SETB P1.0；停止放電

；

JZ YX7；脈沖次數到?

DEC 51H

MOV 50H，#9

SJMP YX8

；

YX7:CLR P1.6 ；工作結束蜂鳴器打開

；

CJNE A，#1，YX9_3；脈沖間隔時間到？

MOV A，53H

JNZ YX9_2

CLR TR0

AJMP YX4

YX9_1:LCALL CCS_1

LCALL ML

LCALL DIR

SJMP YX8

；

4 實驗結果

高壓電脈沖發生器產生的脈沖直流電壓為0～1 000 V，脈沖持續時間為1～999 μs，脈沖間隔時間為1～99 s，脈沖次數為1～99次，電擊槽有效容積為20 mm×25 mm×（20～40） mm三檔可調。將要處理的植物樣品放入電擊槽內，并將可調電極板預插到適當插槽中，加入適量緩沖液。將脈沖電壓、脈沖持續時間、脈沖間隔時間、脈沖次數等各項參數調整到一個適當的數值上，經過高壓電脈沖對植物樣品的不斷適當的刺激，使植物培養組織在微電流的作用下得到有效的激活，在適當的培養條件下經過一段時間的培養，便有可能影響到植物培養組織的生長和芽的分化。本課題組在櫻桃亞屬植物組織培養的離體再生研究中，已開始研究應用本儀器，初步實驗結果表明微電流處理后櫻桃葉片和愈傷組織分化再生芽的能力得到一定程度的提高。進一步的深入研究還在進行中。

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