黃河故道地區葡萄根結線蟲rDNA- ITS-PCR研究

摘 要： 用PCR方法擴增來自黃河故道地區不同區域葡萄根結線蟲群體的ITS片段，并進行克隆和序列分析。結果表明，來自6個不同采集點的供試線蟲屬于同一種群，獲得的ITS序列長度為766 bp，與已知南方根結線蟲ITS區編碼序列一致性達到99.74%；聚類結果顯示，與南方根結線蟲親緣關系最近。結合形態鑒定結果，初步確定黃河古道地區葡萄根結線蟲病病原為南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）。

關鍵詞： 葡萄； 根結線蟲病； 南方根結線蟲； ITS-PCR； 序列分析

中圖分類號：Ｓ６６1．1 文獻標識碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1104－０3

Study on rDNA -ITS-PCR of root-knot nematode in grape in the Chinese Yellow River east region

LIU San-jun1，2， YU Qiao-li2， LI Hong-lian1*

（1Plant protection College，Henan Agricultural University， 2Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou， Henan 450000 China）

Abstract: The amplification， cloning and sequencing of the rDNA-ITS region of 6 different populations of root-knot nematodes from trail of the Yellow River east region were conducted. The sequence analysis results showed that six populations of root-knot nematodes on grape from Luoyang， Zhengzhou， Kaifeng， Shangqiu in Henan Province and Dangshan， Xiaoxian in Anhui Province belong to Meloidogyne incognita. The length of ITS was 766 bp. The results of the sequence analysis and the form identifications showed that this pathogen was Meloidogyne incognita.

Key words: Grape； Root-knot nematode disease； Meloidogyne incognita； ITS-PCR； Sequence analysis

自1889年Neal首次報道加州的葡萄發生根結線蟲病[1]以來，葡萄根結線蟲病已成為制約葡萄生產的世界性病害，危害日益嚴重。危害葡萄的根結線蟲在世界的分布主要有4種：南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）、花生根結線蟲（M. arenaria）、爪哇根結線蟲（M. javanica）和北方根結線蟲（M. hapla）[2-3]。

葡萄種植在黃河古道地區有悠久歷史，伴隨而來的葡萄根結線蟲病普遍發生，對葡萄生產和育苗造成很大的危害[4]，但病原線蟲種類卻未有明確報道。近年來，分子鑒定已應用于根結線蟲的分類鑒定中并取得了很大的進展[5-7]。ITS是核糖體DNA中介于18S和28S之間的內轉錄間隔區，它們在生物進化過程中顯示種的特征，在種內具有高度保守性，在不同種間又有不同程度的變異，是最廣泛應用于寄生蟲種間分類鑒定的理想遺傳標記[8-11]。我們對本地區的葡萄感病病株進行了病原線蟲的分離培養，從形態學和分子生物學兩方面對其進行鑒定，以明確黃河故道地區的葡萄根結線蟲種類，為線蟲病害防治、線蟲與寄主間的分子互作、抗線蟲基因的篩選和利用等提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

于2008年6月采集感染線蟲葡萄根系，帶回試驗室，用強水流沖洗，選擇膨大根結，挑取成熟雌蟲和卵囊備用。其編號和來源見表1。

1.2 方法

1.2.1 根結線蟲形態鑒定 將成熟卵囊置滅菌水中，25 ℃培養24 h。收集二齡幼蟲，在顯微鏡下觀察其形態并照相。挑取成熟雌蟲，觀察其形態并照相。 鑒定標準參照劉維志等[12]的方法。

1.2.2 根結線蟲DNA提取 參考歐師琪等[6]的方法并加以改進，具體方法為：挑取1個成熟卵囊放入滅菌的Eppendorf管中搗碎，加入10 μL滅菌重蒸水，25 ℃培養24 h，獲得二齡幼蟲，充分攪勻后去雜質，-20 ℃冷凍2 h，用滅菌牙簽的端部充分研磨2~5 min，再加入9 μL蛋白酶K溶液（1 g·L-1）（Promega，USA） ，離心30 s，繼續-20 ℃冷凍2 h，將Eppendorf管置65 ℃下溫浴1 h，95 ℃ 10 min，最后12 000 r·min-1 離心1 min，取上清DNA懸浮液-20 ℃保存備用。

1.2.3 ITS-PCR擴增 選擇擴增線蟲rDNA-ITS區的通用引物，序列為：引物1（18S）：5’-TTGA TTAC GTCC CTGC CCTT T-3’引物2（28S）：5’-TTTC ACAC GCCG TTAC TAAG G-3’。

采用50 μL的PCR反應體系，10×PCR Buffer 5 μL，引物各1 μL，模板DNA 10 μL，Premix Taq DNA 多聚酶25 μL，滅菌重蒸水補足到50 μL。 擴增條件為94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產物采用1.0%瓊脂糖凝膠（含EB）100V電泳30 min，紫外檢測、照相。

1.2.4 PCR產物的回收 PCR產物采用TIANGEN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收純化，具體操作步驟參照試劑盒操作說明。

1.2.5 PCR產物的克隆、測序和序列分析 將純化后的PCR產物進行連接轉化，提取重組質粒DNA，經PCR鑒定后，篩選出含有正確插入片段的重組克隆送上海英俊公司測序。將測定的序列在NCBI中利用BLAST程序進行同源性搜索，采用DNAMAN、CLUSTALX、MEGA等分子生物學軟件對克隆片段與已報道的根結線蟲序列進行同源性比對，并生成系統聚類圖。

2 結果與分析

2.1 病原線蟲形態鑒定結果

挑取病株根結進行觀察，可以看到根結外有透明黃褐色膠質包含著的卵囊，在顯微鏡下可以看到卵囊里充滿了長橢圓形的卵，挑取卵囊，可以看到與卵囊緊密相連的呈梨形的雌蟲，蟲體乳白色，前體部突出呈現為瓶頸狀，后體呈現為球形，食道墊刃型，中食道球發達，具有口針（圖版-A）。二齡幼蟲線形，長度約為500 μm，頭部可以看到發育良好的食道腺和口針（圖版-B）。觀察到的形態特征與劉維志[12]對根結線蟲的特征描述相一致，由此初步判斷病原線蟲為根結線蟲。

2.2 根結線蟲rDNA-ITS的PCR擴增結果

對ITS-PCR擴增結果進行電泳檢測，得到大小約為800 bp（圖1）的6個ITS片段， 說明從6個不同地區采集到得根結線蟲的ITS片段大小一致。

2.3 序列分析及同源性比較結果

測序結果表明，6個線蟲樣品的ITS序列長度一致，均為766 bp，且堿基序列無差異，說明屬于同一個種；在NCBI上進行序列對比，發現它與南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）的ITS區編碼序列（序列號為AY438556）具有極高同源性，一致性達到99.74％，ITS序列的聚類分析結果見圖2。

3 討 論

根結線蟲的鑒定方法主要分為形態鑒定和分子鑒定2種，形態鑒定又以雌蟲會陰花紋和同工酶鑒定方法為主，但雌蟲會陰花紋個體間常常存在差異，并且在標本制作上需要一定的技巧，同工酶鑒定雖然較為準確，但卻需要年輕雌蟲的存在，因而限制了該方法的應用[12]。近年來國際上興起的根結線蟲各蟲態分子診斷方法的研究，不僅靈敏、快捷、準確，而且可操作性強、重復性好、適用范圍廣，在多種果樹根結線蟲病害以及多種線蟲群體的鑒定上發揮了重要作用。

試驗采用根結線蟲rDNA-ITS-PCR擴增的方法，用一對擴增根結線蟲ITS區通用引物對我國黃河故道地區葡萄根結線蟲群體進行了鑒定，首次明確了該地區危害葡萄的根結線蟲種類為南方根結線蟲（M. incognita）。為今后黃河故道地區葡萄根結線蟲的研究和防治提供了理論依據，為葡萄抗線蟲基因克隆、抗線蟲育種奠定了基礎。

目前，由于抗線蟲基因的單一性，而大部分化學殺線劑都會引起環境污染，因此，快速準確的對病原線蟲的鑒定，對于應用葡萄抗線蟲性、抗性砧木的篩選、檢疫以及防治根結線蟲病害，確保葡萄的高產及安全生產具有極其重要的意義。（本文圖版見插5）

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