獼猴桃EST-SSR引物篩選及通用性分析

摘 要：應(yīng)用SSRHunter軟件對(duì)NCBI公共數(shù)據(jù)庫中的獼猴桃EST序列進(jìn)行篩查，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行篩選，同時(shí)對(duì)其在部分柑橘類植物的通用性進(jìn)行分析。以漓江獼猴桃DNA為模板，對(duì)所設(shè)計(jì)的97對(duì)EST-SSR引物進(jìn)行篩選，結(jié)果表明其中77對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰條帶，有效擴(kuò)增率為79.38%。隨機(jī)選取20對(duì)引物對(duì)10份獼猴桃資源進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有17對(duì)引物對(duì)所有材料都有擴(kuò)增產(chǎn)物并呈現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性擴(kuò)增率為85%。隨機(jī)應(yīng)用20對(duì)有效EST-SSR引物對(duì)興津、金柑、枳殼、椪柑、酸柚、甜橙、胡柚、尾張、宮川等柑橘類植物基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明，其中有11對(duì)引物在供試材料中有擴(kuò)增產(chǎn)物，占引物總數(shù)的55%；有8對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性，擴(kuò)增率為72.7%。據(jù)此，基于獼猴桃EST序列而篩選的SSR引物在柑橘類植物中具有一定的通用性。

關(guān)鍵詞： 獼猴桃； EST-SSR； 引物篩選； 柑橘； 通用性

中圖分類號(hào)：Ｓ６６3．4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1111－０6

Mining and transferability analysis of EST-SSR primers in Kiwifruit (Actinidia spp.)

LIAO Jiao， HUANG Chun-hui， GU Qing-qing， QU Xue-yan， XU Xiao-biao*

(College of Agronomy， Jiangxi Agricultural University， Nanchang， Jiangxi 330045 China)

Abstrat: ESTs of Actinidia in the NCBI database were downloaded and screened by SSRHunter software， the EST-SSR primers were designed by Primer 5.0， and their transferabilities were analyzed in some Citrus plants. The 97 EST-SSR primers which were deigned were mined by using genomic DNA of Actinidia lijiangensis. The results indicated that the 77 pairs of primer showed amplification， accounting for 79.38%. Twenty pairs of primer selected were detected to PCR for DNAs from 10 Actinidia varieties， the 17 primer pairs of the 20 showed amplification and polymorphism， accounting for 85%. The transferability of 20 pairs of EST-SSR primers which were randomly selected was explored in 9 Citrus germplasms (Okitsu， Kumquat， Trifoliate Orange， Ponkan， Sour Pummelo， Sweet Orange， Huyou， Owari， Miyagawa). The results showed that the 11 primer pairs of the 20 tested primers had the amplification， accounting for 55%. And the 8 primer pairs showed polymorphism， accounting for 72.7%. The results revealed that the EST-SSR markers in Actinidia were transferable in some Citrus germplasms.

Key words: Kiwifruit (Actinidia)； EST-SSR； Mining of primers； Citrus； Transferability

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR），也叫微衛(wèi)星（Microsatellites）。與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，SSR標(biāo)記具有多態(tài)信息含量高、共顯性遺傳、技術(shù)簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[1]，已被應(yīng)用于蘋果、葡萄、柑橘和果梅等果樹基因組研究中[2-6]。

表達(dá)序列標(biāo)簽（Express Sequence Tags，EST），是指通過cDNA文庫中隨機(jī)挑取的克隆進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序所獲得的cDNA的5’或3’端序列，長(zhǎng)度一般為150～500 bp[7]。近年來大量快速增長(zhǎng)的EST數(shù)據(jù)已成為SSR的重要來源，各種植物中約有1%～5%的EST含有可用于建立標(biāo)記的SSR[8]。EST-SSR標(biāo)記具有信息量大，通用性好，開發(fā)簡(jiǎn)單快捷、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，是一種新型簡(jiǎn)便、快速有效的分子標(biāo)記，并被證明有多方面的利用價(jià)值和功能性[9-10]。

獼猴桃隸屬于獼猴桃科（Actinidiaceae） 獼猴桃屬（Actinidia Lindl.），為多年生藤本果樹，它是20 世紀(jì)人工馴化栽培野生果樹最有成就的四大果種之一[11]。全世界獼猴桃共有75種，約125個(gè)分類群（變種或變型）[12]。獼猴桃歷史悠久、分布廣泛，種質(zhì)資源極為豐富，但對(duì)其有關(guān)分子生物學(xué)的研究卻較為薄弱。引物數(shù)量不足制約了SSR標(biāo)記的發(fā)展，因此有必要進(jìn)一步開發(fā)獼猴桃SSR引物。除傳統(tǒng)的基于實(shí)驗(yàn)手段的文庫法、富集法、省略篩庫法和不同物種間共用引物篩選法外，還有用生物信息學(xué)手段來設(shè)計(jì)和開發(fā)SSR引物的方法。而后者也是更方便、快捷、開發(fā)成本低的手段。目前，公共數(shù)據(jù)庫中的獼猴桃EST序列為開發(fā)新的獼猴桃SSR引物提供了便利。EST作為基因的一部分，EST-SSR側(cè)翼序列在物種之間有高度的保守性，其標(biāo)記也適合在物種間轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)在有許多關(guān)于不同科或者同科不同屬間物種的SSR標(biāo)記轉(zhuǎn)移擴(kuò)增成功的報(bào)道，鄭麗珊等[13]首次對(duì)不同綱物種間的SSR標(biāo)記通用性進(jìn)行了研究，證明了一物種的SSR分子標(biāo)記在遺傳背景差異大的植物中也同樣有轉(zhuǎn)移擴(kuò)增的能力。引物的通用性和多態(tài)性是影響基因組比較作圖研究的基礎(chǔ)，SSR標(biāo)記目前只在擬南芥、水稻等少數(shù)模式作物中得到大量開發(fā)[14]。為了以較少的投入，獲得較多的遺傳信息，我們嘗試進(jìn)行獼猴桃EST-SSR引物在柑橘類作物中的通用性研究，為柑橘類作物繼續(xù)深入開展研究提供便利，對(duì)于柑橘類作物基因組學(xué)研究，尤其是構(gòu)建高密度遺傳圖譜及種質(zhì)資源的收集、保存和評(píng)價(jià)都具有重要意義。我們通過篩查獼猴桃EST序列數(shù)據(jù)庫，發(fā)掘SSR位點(diǎn)，設(shè)計(jì)SSR位點(diǎn)兩側(cè)的特異引物，并對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行有效性及多態(tài)性檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)其在柑橘類植物的通用性，為后續(xù)分子生物學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用材料為棕毛獼猴桃（Actinida fulvicome）、長(zhǎng)葉獼猴桃（A. hemsleyana）、狗棗獼猴桃（A. kolomikta）、四萼獼猴桃（A. tetramera）、大籽獼猴桃（A. macrosperma var. macrosperma）、漓江獼猴桃（A. lijiangensis）、網(wǎng)脈獼猴桃（A. cylindrica var. reticulata）、闊葉獼猴桃（A. latifolia var. latifolia）、對(duì)萼獼猴桃（A. valvata var. valvata）及粗葉獼猴桃（A. glaucophylla var. robusta）10個(gè)獼猴桃種類的幼葉，采自中國(guó)科學(xué)院武漢植物研究所獼猴桃種質(zhì)資源圃。引物通用性所用試驗(yàn)材料為興津（Okitsu）、金柑（Kumquats）、枳殼（Trifoliate Orange）、椪柑（Ponkan）、酸柚（Sour Pummelo）、甜橙（Sweet Orange）、胡柚（Huyou Pummelo）、尾張（Owari）、宮川（Miyagawa），采自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)科技園。

1.2 DNA提取

田間采樣攜帶硅膠，每份材料采4~5片幼葉，用硅膠干燥保存。DNA的提取采用CTAB法[11]并加以改進(jìn)。

1.3 EST序列搜索

在NCBI dbEST數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.heml）中，以Actinidia為關(guān)鍵詞搜索EST序列。在“Display”下拉框中，選擇輸出格式為FASTA，在“send to”下拉框中，選擇輸出方式為File，下載所有中華獼猴桃EST序列，保存至本地電腦備用。

1.4 EST序列處理及搜索SSR位點(diǎn)

采用EST-trimmer程序去除小于100 bp的低質(zhì)量片段，在剩余無冗余的EST序列中，隨機(jī)抽取其中56 400條序列，用SSRHunter1.3軟件進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索。搜索的標(biāo)準(zhǔn)是：7次以上重復(fù)的雙堿基序列，5次以上重復(fù)的三堿基序列，4次以上重復(fù)的四堿基序列和3次以上重復(fù)的五堿基序列與六堿基序列。

1.5 引物設(shè)計(jì)

從獲取的EST序列中，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，選擇的標(biāo)準(zhǔn)是：10次以上重復(fù)的雙堿基重復(fù)序列，7次以上重復(fù)的三堿基序列，5次以上重復(fù)的四堿基序列和五堿基序列及4次以上重復(fù)的六堿基序列。引物長(zhǎng)度在18~24 bp，Tm值控制在58 ℃左右，盡量避免二級(jí)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)物長(zhǎng)度控制在125~300 bp。引物由上海杰瑞合成。共設(shè)計(jì)97對(duì)引物。

1.6 EST-SSR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為20 μL，各成份用量分別為：Mg2+ 2.0 mmol·L-1；dNTP 0.25 mmol·L-1 ；引物0.3 μmol·L-1；DNA 60 ng；Taq DNA酶1 U。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性180 s，然后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性30 s，45~60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸240 s，最后于4 ℃保存。

1.7 PCR產(chǎn)物檢測(cè)

獼猴桃PCR產(chǎn)物用6%丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，銀染步驟參照Brant等[15]的方法略作改進(jìn)。通用性PCR產(chǎn)物檢測(cè)用2.5%瓊脂糖凝膠。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃EST序列中SSR的頻率及特性

對(duì)來源于獼猴桃EST數(shù)據(jù)庫（NCBI dbEST）的56 400條單一基因序列使用SSRHunter進(jìn)行了簡(jiǎn)單序列重復(fù)SSRs搜索。結(jié)果表明，獼猴桃EST-SSR類型豐富，但頻率各不相同。從中共獲得含SSR的EST序列7 939條，其中包括二核苷酸重復(fù)5 131條，三核苷酸重復(fù)1 237條，四核苷酸重復(fù)284條，五核苷酸重復(fù)397條，六核苷酸重復(fù)890條，分別占總SSR的64.63%、15.58%、3.58%、5.00%和11.21%。其中，二核苷酸重復(fù)是最豐富的重復(fù)單元，其次為三核苷酸重復(fù)和六核苷酸重復(fù)。在所獲得的SSR重復(fù)單元中，AG/CT為優(yōu)勢(shì)重復(fù)，共分布4 654條，占二核苷酸重復(fù)中各重復(fù)基元的90.70%。其次是AT/AT重復(fù)，共分布286條，占二核苷酸重復(fù)中各重復(fù)基元的5.57%。

在三苷核酸中，最為豐富的3種重復(fù)基元是ACC/GGT，AAG/CTT和CGC/GCG，共分布817條，它們占三核苷酸重復(fù)中各重復(fù)基元的66.04%。其他基元包括AGG/CCT、AGC/GCT、AAC/GTT、ATC/GAT、AGT/ACT、CGA/TCG、AAT/ATT等7種重復(fù)基元，共420條SSR序列，占33.96%。在所分析的序列中未見AGT與CGT重復(fù)基元。

2.2 引物有效性檢測(cè)

以漓江獼猴桃為模板對(duì)引物進(jìn)行篩選。在97對(duì)引物中，有77對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰條帶，有效擴(kuò)增率為79.38%。其余引物通過再次優(yōu)化反應(yīng)體系均無擴(kuò)增產(chǎn)物。用20對(duì)在漓江獼猴桃中能擴(kuò)增出清晰條帶的引物對(duì)10個(gè)獼猴桃種類進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)17對(duì)引物對(duì)所有材料都有擴(kuò)增產(chǎn)物，引物的擴(kuò)增效率為85%。且有擴(kuò)增產(chǎn)物的17對(duì)引物在所檢測(cè)的10個(gè)獼猴桃種類間均能擴(kuò)增出多態(tài)性，多態(tài)性擴(kuò)增率為100%（表1）。

2.3 引物對(duì)柑橘類植物的通用性檢測(cè)

20對(duì)EST-SSR引物中，有11對(duì)引物（Acd01、Acd03、Acd04、Acd07、Acd12、Ad001、Ad002、Ad010、Ad048、Ad049、Ad035）在柑橘類植物中都有擴(kuò)增產(chǎn)物，占引物總數(shù)的55%，有8對(duì)引物（Acd01、Acd03、Acd04、 Acd07、Acd12、Ad002、 Ad010、Ad001）的擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性，多態(tài)性擴(kuò)增率為72.7%，占總引物的40%。

引物在柑橘類植物中的擴(kuò)增產(chǎn)物與在獼猴桃中的擴(kuò)增產(chǎn)物大小不一致，絕大多數(shù)引物除擴(kuò)增出預(yù)期的片段外，都同時(shí)出現(xiàn)了比預(yù)期產(chǎn)物大的片段（表2）。引物Acd04、Acd07在柑橘類植物中的擴(kuò)增產(chǎn)物為預(yù)期大小片段，引物Acd01、Acd03、Acd12、Ad010及Ad001的擴(kuò)增產(chǎn)物包含預(yù)期大小片段和非預(yù)期大小片段，引物Ad002的擴(kuò)增產(chǎn)物為非預(yù)期大小片段。其余9對(duì)引物不能在供試材料中擴(kuò)增。圖1為引物Ad035、Acd03、Ad048及Ad010的擴(kuò)增圖。引物Ad035及引物Ad048在9份供試柑橘類植物種質(zhì)中擴(kuò)增出單一條帶，且均無差異。引物Acd03的擴(kuò)增條帶最多，100~600 bp均有分布。引物Ad010檢測(cè)出3種基因型，在金柑中擴(kuò)增出獨(dú)有的條帶（300~400 bp），在枳殼、椪柑、酸柚、甜橙、胡柚中為單一的同大小片段（500 bp左右），而溫州蜜柑早熟品種興津、宮川與中熟品種尾張的基因型一致。研究結(jié)果表明，基于中華獼猴桃EST序列而建立的EST-SSR標(biāo)記在柑橘類植物中也具有一定的通用性，這對(duì)于獼猴桃的比較基因組學(xué)研究也具有重要的利用價(jià)值。

3 討 論

根據(jù)EST序列設(shè)計(jì)SSR引物是較方便、快捷、開發(fā)成本低的手段，較多人進(jìn)行了實(shí)踐。李華盛等[16]合成25對(duì)棉花EST-SSR引物，其中有24對(duì)引物有擴(kuò)增產(chǎn)物，17對(duì)引物的擴(kuò)增條帶比較清晰。胥猛等[17]設(shè)計(jì)了176對(duì)鵝掌楸EST-SSR引物，有132對(duì)引物有擴(kuò)增產(chǎn)物。林范學(xué)等[18]設(shè)計(jì)了51對(duì)香菇EST-SSR引物，有39對(duì)引物有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，有效擴(kuò)增率為76.47%。劉公秉等[19]根據(jù)松樹的EST序列設(shè)計(jì)出135對(duì)引物，有51對(duì)可擴(kuò)增，擴(kuò)增率為37.78%，其中有39對(duì)引物表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性擴(kuò)增率為28.89%。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了97對(duì)獼猴桃EST-SSR引物，有77對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰條帶，有效擴(kuò)增率為79.38%，擴(kuò)增率相對(duì)較高。但在20對(duì)有效引物中，只有17對(duì)引物在10份獼猴桃種質(zhì)均有擴(kuò)增產(chǎn)物，其余3對(duì)引物只能在部分獼猴桃種質(zhì)中擴(kuò)增。可能是測(cè)試的材料增多，它們之間的遺傳變異也增大。加上所用引物是根據(jù)獼猴桃中的獼猴的EST序列來設(shè)計(jì)的，EST序列具有保守性，并不能在所有的獼猴桃種中都有擴(kuò)增產(chǎn)物。在所有材料中都有擴(kuò)增產(chǎn)物的17對(duì)引物均能擴(kuò)增出多態(tài)性，所研究的材料屬不同種，具有很好的遺傳多樣性，而引物設(shè)計(jì)時(shí)也選用了SSR重復(fù)次數(shù)較高的EST，這就增大了引物在不同材料間的多態(tài)性擴(kuò)增率。

基因組SSR的擴(kuò)增多態(tài)性較高，而來自EST的SSR擴(kuò)增多態(tài)性低，但EST-SSR引物開發(fā)成本低、效率高，由于其來源于基因表達(dá)序列，信息含量豐富，且側(cè)翼序列的保守程度和SSR進(jìn)化的穩(wěn)定性決定著同一種EST-SSR引物在不同物種間的通用性。因此，EST標(biāo)記適用于遠(yuǎn)緣物種間比較基因組研究。對(duì)缺少DNA序列的物種，來源于其他種的EST-SSR標(biāo)記是有效和可用的資源。

本研究用20對(duì)基于獼猴桃EST序列設(shè)計(jì)的SSR引物，對(duì)柑橘部分種與品種間進(jìn)行擴(kuò)增，研究結(jié)果顯示，55%的引物在柑橘類植物中有擴(kuò)增產(chǎn)物，且有8對(duì)引物擴(kuò)增出多態(tài)性。前人在其他植物的EST-SSR引物通用性方面做了研究，如李宏偉等[20]根據(jù)小麥ESTs 設(shè)計(jì)的597對(duì)EST-SSRs 引物在小麥、玉米、水稻和大豆中的有效擴(kuò)增比率分別為80 %、65.8 %、62.1 %和58.1 %，其中，255 對(duì)EST-SSRs 引物（42.7%） 在4種作物中都能獲得預(yù)期產(chǎn)物；Holton等[21]的研究表明，大麥EST-SSR標(biāo)記對(duì)小麥通用性達(dá)55%；Gupta等[22]的研究結(jié)果顯示，40.68%以上的小麥EST-SSR引物能夠在大麥、燕麥、黑麥、水稻和玉米中具有通用性；高羊茅的EST-SSR引物在水稻和小麥中的擴(kuò)增率分別為59%和71%[23]。在美鵝掌楸中表現(xiàn)多態(tài)的66對(duì)EST-SSR引物有85%的引物在中國(guó)馬褂木中有擴(kuò)增，54%在白玉蘭中有擴(kuò)增[17]。相對(duì)于前人的研究，本試驗(yàn)檢測(cè)的引物通用性擴(kuò)增率并不高，為55%，但仍能證明由獼猴桃EST序列而建立的SSR標(biāo)記對(duì)柑橘類植物具有通用性。本試驗(yàn)中引物的通用性僅是通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，而瓊脂糖電泳只能區(qū)分分子量相差較大的片段。因此，如采用分辨率更高的聚丙烯酰胺凝膠電泳，呈現(xiàn)的多態(tài)性水平將會(huì)更高。

近年來，國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫中獼猴桃的ESTs數(shù)據(jù)日益增多，這些快速增長(zhǎng)的ESTs數(shù)據(jù)為EST-SSR引物的開發(fā)提供了寶貴的數(shù)據(jù)資源。從EST數(shù)據(jù)庫中開發(fā)的這些引物勢(shì)必對(duì)獼猴桃遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、比較基因組學(xué)以及重要基因篩選與發(fā)掘等領(lǐng)域產(chǎn)生重大影響。而本試驗(yàn)研究獼猴桃EST-SSR引物在柑橘屬物種間的通用性，亦為柑橘類植物標(biāo)記開發(fā)提供了新的途徑，也使物種間比較圖譜的繪制更為便捷。

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