38個(gè)歐美草莓栽培品種SSR指紋圖譜的構(gòu)建

摘 要：為了建立草莓品種指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，從而對(duì)不同草莓品種進(jìn)行分子鑒定，以早光、因都卡、達(dá)賽萊克特、森加拉等38個(gè)歐美草莓栽培品種為試材，利用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)。通過(guò)對(duì)各種影響因素不同濃度梯度的比較，得出優(yōu)化的SSR擴(kuò)增反應(yīng)體系，25 μL PCR的反應(yīng)體系中各成分為：1×Buffer；2.5 mmol·L-1 MgCl2；0.4 μmol·L-1 引物；1.5 U Taq酶；0.2 mmol·L-1 dNTP；60 ng DNA。從44對(duì)引物中篩選出帶型清晰、多態(tài)性豐富的10條SSR引物。最終確定了4對(duì)SSR引物作為核心引物對(duì)38個(gè)草莓品種進(jìn)行了分子圖譜的構(gòu)建，29個(gè)草莓品種可以完全與其他品種區(qū)分開(kāi)。

關(guān)鍵詞： 草莓； 指紋圖譜； 分子標(biāo)記； SSR

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｓ６６8．4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1032－０6

Establishment of SSR fingerprinting database for 38 cultivars of strawberry (Fragaria ananassa) native to Europe and America

WANG Zhuang-wei，ZHAO Mi-zhen， YUAN Ji，WU Wei-min， QIAN Ya-ming

（Institute of Horticulture， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing， Jiangsu 210014 China）

Abstract: The total DNA of 38 strawberry cultivars originating in Europe and America ，such as Earliglow， Induka， Darselect ，Senga， Litessa， were amplified by 44 pairs of SSR primers. The PCR products were separated in 8% polyacrylamide sequencing gels. Some factors which affected amplified products，such as dNTPs，Taq DNA polymerase，primer and so on were also studied. Optimum condition was as follows：25 μL PCR reaction system consisted of 1×PCR Buffer， 2.5 mmol·L-1 MgCl2， 0.4 μmol primer， 0.2 mmol dNTP， 1.5 U Taq polymerase and 60 ng DNA. The amplification conditions were 94 ℃ for 1 min，35 cycles of 94 ℃ for 30 s，annealing temperature for 30 s ，72 ℃ for 30 s and a final extension step at 72 ℃ for 7 min． Ten pairs of primers which could amplify stable and distinct band were selected. The electrophoresis results of the 38 strawberry DNA samples were evaluated and analyzed. Eventually， 29 cultivars could be distinguished by the fingerprint map constructed by only 4 pairs of SSR primers．

Key words: Strawberry； Fingerprinting； Molecular marker； SSR

草莓在世界上廣泛種植，是重要的經(jīng)濟(jì)果樹(shù)。全世界草莓屬約20個(gè)種，2 000多個(gè)品種。草莓通過(guò)匍匐莖營(yíng)養(yǎng)繁殖，容易造成種質(zhì)資源圃或育苗地品種混雜。長(zhǎng)期以來(lái)，人們主要根據(jù)形態(tài)特征來(lái)鑒定區(qū)分草莓品種。草莓育種往往集中利用少數(shù)優(yōu)良親本，遺傳基礎(chǔ)狹窄，栽培草莓多為八倍體，眾多農(nóng)藝性狀為數(shù)量性狀，且草莓的植物學(xué)性狀易受環(huán)境、栽培、氣候等影響，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法常常難以區(qū)分相近的草莓品種[1-2]，品種的純度及品種權(quán)保護(hù)需要可靠的種質(zhì)鑒定方法。

近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，它具有快捷、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，極大彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的缺陷，日益成為品種注冊(cè)登記、品種權(quán)保護(hù)和解決種苗糾紛的重要依據(jù)，涉及到RFLP、RAPD、AFLP及SSR等不同類(lèi)型的標(biāo)記[3-6]。RFLP技術(shù)多態(tài)性表現(xiàn)穩(wěn)定，但需經(jīng)酶切、DNA分子雜交、放射自顯影等過(guò)程，步驟繁瑣而費(fèi)時(shí)，而且在草莓種間特別是與栽培品種關(guān)系最密切的多倍體種間RFLP多態(tài)性很低[7]。RAPD具有快速、簡(jiǎn)便、多態(tài)性豐富的特點(diǎn)，因而已成為至今草莓上研究應(yīng)用最多的分子標(biāo)記。但RAPD-PCR技術(shù)對(duì)試驗(yàn)條件控制要求較高，標(biāo)記穩(wěn)定性較差，重復(fù)性欠佳，且在八倍體草莓中擴(kuò)增還存在劑量效應(yīng)，擴(kuò)增帶的出現(xiàn)與該位點(diǎn)在基因型中的拷貝數(shù)有關(guān)，給實(shí)際應(yīng)用帶來(lái)一定困難[2，8]。AFLP多態(tài)性豐富可以很好地區(qū)分鑒定草莓品種，但AFLP技術(shù)對(duì)DNA提取質(zhì)量要求很?chē)?yán)格，在草莓不同生長(zhǎng)階段或者不同組織提取的DNA難以獲得重復(fù)性結(jié)果[9]。且八倍體栽培草莓品種多為雜合體，而RAPD和AFLP都非共顯性標(biāo)記，難以檢測(cè)位點(diǎn)的純合與雜合[2]。

SSR標(biāo)記，是一類(lèi)由幾個(gè)核苷酸（一般為2~5 bp）為重復(fù)單位組成的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在物種間、品種間甚至個(gè)體間具有非常大的變異性，很多作物的研究表明，SSR標(biāo)記分布于整個(gè)基因組，具有數(shù)量豐富，等位變異高，共顯性，檢測(cè)簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛應(yīng)用[10-11]。多倍體草莓中顯性標(biāo)記呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，SSR穩(wěn)定性好且呈共顯性遺傳，作為草莓分子標(biāo)記技術(shù)方法更為理想[2]。近年來(lái)草莓SSR引物數(shù)據(jù)不斷增加，得到廣泛的研究應(yīng)用。

近年來(lái)，國(guó)外科研工作者開(kāi)發(fā)了大量的草莓SSR引物，并已應(yīng)用于遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建等方面[1，12-13]。但國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)草莓SSR分子標(biāo)記的研究報(bào)道，指紋圖譜構(gòu)建的研究也很少。我們以栽培品種為試材，建立了草莓SSR-PCR反應(yīng)體系，并利用SSR標(biāo)記建立了草莓38個(gè)歐美品種指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，以期為鑒定品種，保證品種的真實(shí)性和純度，維護(hù)生產(chǎn)者和育種家的利益奠定基礎(chǔ)，并為進(jìn)行草莓種質(zhì)的指紋圖譜鑒定和數(shù)據(jù)管理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試品種加拿大、因都卡、達(dá)賽萊克特、森加拉等38個(gè)歐美草莓種質(zhì)均取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)南京桃草莓圃（表1）。

1.1.2 試劑及設(shè)備 TaqDNA聚合酶、dNTP等購(gòu)于MBI Fermentas公司， 常規(guī)試劑均為分析純。PCR反應(yīng)在德國(guó)生產(chǎn)的Biometra T1上進(jìn)行，離心機(jī)使用BACKMAN X-22R。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 參考陳大明等[14]方法，略作修改，提取草莓葉片基因組DNA并進(jìn)行DNA樣品的濃度和純度的測(cè)定，將DNA樣品稀釋至10 mg·L-1備用。

1.2.2 引物合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)[15-16]，選擇了來(lái)自草莓屬的44對(duì)SSR引物，由英駿生命技術(shù)有限公司合成（表2）。

1.2.3 SSR-PCR擴(kuò)增 （1）PCR反應(yīng)體系。為獲得穩(wěn)定可靠的試驗(yàn)結(jié)果，在25 μL反應(yīng)體系中對(duì)各個(gè)成分進(jìn)行優(yōu)化，以期最終確定PCR的最佳反應(yīng)體系。（2）PCR反應(yīng)程序。 94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 30 s，Ta 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存待電泳檢測(cè)。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的檢測(cè) 采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳后銀染染色。 1.2.5 引物篩選及指紋圖譜的構(gòu)建 利用白燈箱觀察電泳結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并拍照。從44對(duì)引物中篩選出條帶清晰、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定的引物對(duì)品種進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)組合鑒別結(jié)果確定核心引物構(gòu)建指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓SSR反應(yīng)體系的建立

由圖1可知，dNTP濃度從0.15～0.4 mmol·L-1 5個(gè)濃度梯度中均得到相同擴(kuò)增產(chǎn)物，但相比之下，當(dāng)dNTP用量為0.2 mmol·L-1 時(shí)，可以得到理想的擴(kuò)增效果，因此，確定dNTP適宜用量為0.2 mmol·L-1 ；隨著引物濃度的增加，擴(kuò)增條帶亮度增加，濃度為0.2 mmol·L-1 時(shí)，條帶很弱，濃度為0.5 mmol·L-1 時(shí)可能是引物過(guò)量引起引物與模板非特異性配對(duì)增加，濃度在0.3～0.4 mmol·L-1 時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果條帶清晰，基本一致，確定引物適宜用量為0.4 mmol·L-1 ；隨著Mg2+濃度的增加，擴(kuò)增條帶逐漸加深，當(dāng)Mg2+濃度為3.0 mmol·L-1 時(shí)，擴(kuò)增的特異性降低，條帶產(chǎn)生彌散現(xiàn)象。選用條帶最清晰2.5 mmol·L-1 為適宜濃度。由圖2可知，當(dāng)Taq酶濃度在0.5～1.5 U時(shí)，擴(kuò)增帶清晰一致，濃度為2.0、2.5 U時(shí)，擴(kuò)增帶有彌散現(xiàn)象，背景模糊，不易觀察，故選用1.5 U為適宜濃度。DNA濃度為10、20 ng時(shí)，擴(kuò)增帶較淺；濃度為80 ng時(shí)，擴(kuò)增帶彌散不清；濃度為40、60 ng時(shí)條帶清晰，60 ng的條帶最為清晰，故確定60 ng為最佳濃度。最終確定25 μL PCR的反應(yīng)體系中各成分為： 1×Buffer；2.5 mmol·L-1 MgCl2；0.4 μmol·L-1 引物；1.5 U Taq酶；0.2 mmol·L-1 dNTP；60 ng DNA。

2.2 SSR引物的篩選

利用44對(duì)SSR引物，對(duì)10個(gè)隨機(jī)試驗(yàn)樣本進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增分析。44對(duì)SSR引物擴(kuò)增結(jié)果的多態(tài)性水平有較大差異，條帶數(shù)最少為3條，最多的達(dá)到19條，片段大小為93～298 bp。從中篩選了擴(kuò)增帶型穩(wěn)定、多態(tài)性豐富、重復(fù)性較好、帶型清晰的P7、 P16、 P18、 P19、 P20、 P22 、P26 、P33、 P34、 P35 10對(duì)引物（表3），對(duì)38份草莓品種正式進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增分析。

2.3 DNA指紋圖譜的構(gòu)建

從10對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果看，10對(duì)引物都能將38份品種區(qū)分為幾個(gè)類(lèi)型，但單一引物都無(wú)法區(qū)分所有品種。6、15與27；11與35；13與25；26與31；10對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果的帶型都相同，無(wú)法相互區(qū)分開(kāi)來(lái)。根據(jù)10對(duì)引物擴(kuò)增的組合鑒別結(jié)果，最終確定了P18、P22、P33 、P35 4對(duì)SSR引物為本研究的核心引物，進(jìn)行DNA指紋圖譜的構(gòu)建。

根據(jù)引物P18的擴(kuò)增結(jié)果，品種2、14、16、17、23、30、37具有特異性帶型，可以與其他品種區(qū)分開(kāi)，品種1、3、6、15、18、27、28、32、34、38帶型相同，品種8、9、10、19、24帶型相同，品種12、22帶型相同，品種4、21、33帶型相同，品種5、20帶型相同，品種7、29帶型相同，品種11、35、36帶型相同，13、25帶型相同，品種26、31帶型相同（圖3）。

根據(jù)引物P22的擴(kuò)增結(jié)果，品種17具有特異性帶，可以與其他品種區(qū)分開(kāi)，品種2、5、11、16、35帶型相同，4、8、12、19、22、23、32帶型相同，13、25帶型相同，9、24、33帶型相同，10、36帶型相同，1、3、6、7、14、15、18、20、21、26、27、28、29、30、31、34、37、38帶型相同（圖4）。

根據(jù)引物P33的擴(kuò)增結(jié)果，品種37具有特異性帶型，可以與其他品種區(qū)分開(kāi)，品種2、3帶型相同，品種1、4、6、8、13、15、19、22、23、24、25、27、30、32、33帶型相同，品種7、9、16、18、20、29、34、36帶型相同，品種5、10、11、12、14、21、26、31、35、38帶型相同，品種17、28帶型相同（圖5）。

根據(jù)引物P35的擴(kuò)增結(jié)果，1、2、7、12、34、37具有特異性帶型，可以與其他品種區(qū)分開(kāi)，品種3、4、5、9、13、14、16、17、18、19、20、21、23、24、25、33、36帶型相同，品種6、15、22、27、28帶型相同，品種8、10、11、26、29、30、31、32、35、38帶型相同（圖6）。

由4個(gè)核心引物擴(kuò)增條帶的組合鑒別結(jié)果看，6、15與27為一類(lèi)；11與35為一類(lèi)；13與25為一類(lèi)；26與31為一類(lèi)；其他29個(gè)品種都可以根據(jù)4個(gè)引物的擴(kuò)增結(jié)果相互區(qū)分開(kāi)來(lái)，建立有效的指紋圖譜。

3 討 論

從研究SSR-PCR體系的優(yōu)化過(guò)程可知SSR對(duì)反應(yīng)條件要求不嚴(yán)格，各反應(yīng)成分均具有較大的適宜范圍，大多數(shù)都能擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰的帶型；在體系優(yōu)化、引物最初篩選、指紋構(gòu)建3個(gè)過(guò)程中，同一引物擴(kuò)增結(jié)果一致，表明SSR標(biāo)記結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性高。SSR分子標(biāo)記操作過(guò)程經(jīng)濟(jì)實(shí)用，簡(jiǎn)單便捷，準(zhǔn)確可靠，對(duì)試驗(yàn)要求不高。國(guó)際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）已將SSR標(biāo)記技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性技術(shù)（SNP）推薦為適合構(gòu)建指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的兩種技術(shù)，認(rèn)為SSR標(biāo)記技術(shù)是目前最為成熟的技術(shù)[17]。

RAPD、AFLP、SSR等分子標(biāo)記手段在國(guó)外已成功地用于指紋圖譜和品種鑒別[18-20]，我國(guó)草莓分子標(biāo)記方面的研究起步較晚，研究報(bào)道不多，主要是利用RAPD和AFLP技術(shù)手段進(jìn)行親緣關(guān)系分析或雜種的鑒定[21-23]，草莓SSR分子標(biāo)記及指紋圖譜構(gòu)建研究很少。本研究應(yīng)用SSR技術(shù)，初步構(gòu)建了草莓基因組DNA指紋圖譜構(gòu)建的技術(shù)體系，最終利用4對(duì)SSR引物能完全區(qū)分親緣關(guān)系較近的29個(gè)歐美品種，為草莓DNA指紋圖譜的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。SSR標(biāo)記技術(shù)還可以利用多個(gè)引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，這將可以大大節(jié)省時(shí)間和成本，該技術(shù)在國(guó)外已有成功報(bào)道[1]，本單位將進(jìn)一步優(yōu)化建立多重SSR標(biāo)記技術(shù)。

本研究中的歐美草莓品種材料采自國(guó)家草莓種質(zhì)資源圃，最初來(lái)源都是國(guó)內(nèi)各單位從國(guó)外引入，在草莓引種過(guò)程中，由于引種單位不同，或引種地區(qū)不同，或最初引種記錄不詳?shù)仍颍斐梢恍┢贩N名稱(chēng)、來(lái)源等資料不詳或不準(zhǔn)確，存在同物異名和同名異物的情況。在本研究中，維斯托爾、S1和里瓦；加拿大四季和波波拉特卡；加拿大和MSU4359；早光和B2；用篩選的條帶清晰多態(tài)性好的10對(duì)引物都未能區(qū)分開(kāi)來(lái)，該結(jié)果有可能是因?yàn)橛H緣關(guān)系很近難以區(qū)分，亦有可能是因?yàn)橐N過(guò)程中造成的同物異名，這還需篩選更多的SSR引物進(jìn)一步擴(kuò)增驗(yàn)證，或結(jié)合其他分子標(biāo)記手段，并根據(jù)植株形態(tài)特征來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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