薄皮甜瓜白啄瓜枯萎病抗性基因Fom-2的同源克隆與表達分析

摘 要： 枯萎病是甜瓜等瓜類作物的毀滅性病害，Fom-2基因介導了甜瓜抗枯萎病生理小種0和1，抗枯萎病育種是甜瓜等瓜類作物育種的重要目標之一。通過同源克隆方法從薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了枯萎病抗性基因Fom-2，推定編碼1 099個氨基酸，所推定的蛋白質序列經Blast分析與數據庫中NBS-LRR類R基因具有較高的同源性。進一步序列分析FOM-2蛋白具有典型的R基因的NB-ARC及SCOP 2個結構功能域。實時熒光定量PCR結果表明，白啄瓜Fom-2基因經枯萎病接種后表達明顯上調。白啄瓜Fom-2基因為白啄瓜抗病育種奠定了基礎。

關鍵詞： 薄皮甜瓜； 白啄瓜； 枯萎病； Fom-2基因

中圖分類號：Ｓ６52 文獻標識碼：Ａ 文章編號：１００９－９９８０?穴２０11?雪０6－1059－０4

Cloning and transcriptional analysis of resistance gene Fom-2 from Cucumis melo ssp. Agrestis Jeffrey

YANG Jia-fu1， ZHAO Xuan2， LIU Ju2， YANG Xiao-dong2， WANG Shi-wei2， YANG Jing-hua2， ZHANG Ming-fang2

（1Vocational College of Science and Technology of Wenzhou， Wenzhou， Zhejiang 325006 China； 2Department of Horticulture， Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang 310029 China）

Abstract: Fusarium wilt （Fusarium oxysporum f. sp. melonis Snyder and Hansen） is one of destructive disease in melon crop production. Fom-2 gene was genetically identified to control the resistance of races 0 and 1. Resistance to fusarium wilt breeding is one of important targets for melon breeding. In this study， we cloned the Fom-2 gene from Baizhuogua melon （Cucumis melo ssp. agrestis Jeffrey） by using homological cloning method， which was deduced to encode 1099 amino acids and exhibited high similarity to NBS-LRR type of R genes in plant. The deduced FOM-2 protein contained NB-ARC and SCOP typical motifs of R gene. The expression of Fom-2 gene was highly induced after inoculation with fom race 1. In conclusion， the cloning of Fom-2 gene is good for breeding with resistance to fusarium wilt .

Key words: Cucumis melo； Baizhuogua； Fusarium wilt； Fom-2 gene

白啄瓜（Cucumis melo ssp. agrestis Jeffrey）屬于薄皮甜瓜類型，是溫州地區的特產瓜類作物，在溫州地區具有很大的栽培面積，栽培面積常年穩定在600~700 hm2。同時，溫州地區還具有接近我國人口最密集的長江三角洲蔬菜瓜果消費市場的區位優勢，當天采摘，當天即可送到市場，運輸費用低，白啄瓜等薄皮甜瓜生產具有非常強的市場競爭能力。近年來，隨著集約化、規模化的栽培，白啄瓜病蟲害擴散蔓延十分迅速，對甜瓜產量和品質造成極大的影響，尤其是枯萎病的影響。侵染甜瓜的枯萎病病原菌屬于甜瓜專化型尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. melonis Snyder and Hansen）。Risser等[1]認為，可將尖孢鐮刀菌甜瓜專化型的病原菌劃分為4個生理小種，分別為race 0、 race 1、race 2和race 1， 2；3個抗病基因，分別為Fom-1、Fom-2和Fom-3，其中：Fom-1抗race 0和2，感race 1和race 1， 2；Fom-2抗race 0和1，感race 2和race 1， 2；Fom-3抗race 0， 1和2，感race 1， 2，且都是顯性基因[2]。Tarek等[3]根據文庫及Wang等[4]得到與Fom-2緊密連鎖的分子標記，通過圖位克隆方法克隆了基因Fom-2，這是到目前為止，甜瓜中唯一克隆到的抗枯萎病基因。在枯萎病的防治中，使用抗性品種是最有效的方法[5]。目前國外已育成的甜瓜抗性品種主要有：Doublon、Charentais與Hemed（含有Fom-1抗性基因）；CM17-187、Charentais 與Makdimon-1（含有Fom-2抗性基因）；MR-1、Top Mark和Perlita FR（含有Fom-3抗性基因）[1-2， 6-7]。我們通過同源克隆方法從薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了枯萎病抗性基因Fom-2同源序列，為白啄瓜抗枯萎病育種奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

材料采用白啄瓜（Cucumis melo ssp. agrestis Jeffrey）高代自交系，由本課題組提供，試驗材料催芽后播種于營養缽中，日光溫室常規條件下生長，待3葉一心時用于總RNA提取及枯萎病接種試驗。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

總RNA的提取采用Plant Mini RNA Extraction Kit（QIAGEN）提取，提取的總RNA經過RNase-free的DNase消化處理，去除基因組污染，所有操作步驟按照試劑盒說明書進行。提取的總RNA經過甲醛變性電泳及濃度測定。取3 μg總RNA，采用Takara的cDNA第1條鏈合成試劑盒合成cDNA第1條鏈，所有操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.3 Fom-2基因的克隆

Fom-2基因的克隆采用同源克隆的方法，由于Fom-2基因大約有3 000 bp左右的長度，本研究中采用2次PCR擴增的方法擴增5’及3’端序列，然后拼接在一起。采用的引物分別為：Fom-2-F1 ATGGGTGATTTCCTATGGACT； Fom-2-R1 AATCA ATCGTGCGTAGCTTG；Fom-2-F2 CAAGCTACGCA CGATTGATT；Fom-2-R2 CAAGTGGGGTTGGAGCATAT，所有引物在數據庫中進行特異性檢測。以cDNA第1條鏈為模板，PCR反應體系為95 ℃ 3 min，然后35個循環，每個循環中95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min。PCR產物經電泳觀察、回收，回收產物連接pMD18-T載體中，熱激發轉化DH5α大腸桿菌，鑒定陽性克隆，選取3個獨立的陽性克隆用于ABI3330上進行序列測定。

1.4 序列分析

序列分析采用NCBI、SWISS、SMART、ProtScale等在線分析及DNAMAN等生物信息學分析工具對核苷酸及蛋白質序列進行分析，進化樹構建采用MEG4.0軟件Neighbor-Joining方法構建。

1.5 枯萎病接種

甜瓜枯萎病生理小種1懸浮孢子的制備，挑取枯萎病生理小種1的菌種，在PDA培養基上培養3 d之后轉接到Bilay培養基上，搖床進行培養（25～28 ℃，100 r·min-1）。培養3 d后經2層紗布過濾后在血球板計數器下檢測孢子的數目并根據檢測情況用培養基將孢子數目調節到106個·mL-1備用。

枯萎病接種采用苗期傷根法接種枯萎病病菌，待瓜苗長至3~4片真葉時，挖出，經清水洗凈后，于孢子懸浮液（孢子懸浮液中含孢子數一般為106 個·mL-1）中浸泡30 min，再植回營養杯培養，10 h后取樣，提取總RNA用于后續基因表達研究。

1.6 實時熒光定量PCR分析

定量引物為（Fom-2_QF1： 5’-TATGCTTGCGAATGTCCAAT-3’；Fom-2_QR1：5’-ACAACTCT CGAACGTGTTGC-3’），以甜瓜18S rRNA作為內參基因。應用ABI step one Real-time PCR system實時定量PCR儀，以cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系為SYBR Green 10 μL，cDNA 2.5 μL，引物0.5 μL，補水至總體積20 μL。反應程序為95 ℃ 10 min，然后40個循環，每個循環中95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s，反應完成后，統計數據進行相對定量分析，3次生物學重復。

2 結果與分析

2.1 白啄瓜Fom-2基因的克隆與序列分析

隨著白啄瓜集約化、規模化的生產，尤其是設施白啄瓜的發展，枯萎病的發生越來越嚴重（圖版-A，B），已經成為制約白啄瓜安全綠色生產的限制因素。

我們通過同源克隆方法，從白啄瓜中克隆到了Fom-2基因，cDNA序列的CDS全長為3 300 bp，推定編碼1 099個氨基酸，采用http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html在線分析得到FOM-2蛋白的等電點為8.08，分子量為126.96 ku左右（圖版-C）。通過SMART在線分析，表明FOM-2蛋白存在2個結構功能域：NB-ARC和SCOP功能域，其中NB-ARC功能域是植物R基因的典型結構功能域，SCOP為富含LRR的結構功能域，對NBS-LRR類R基因的功能十分重要（圖版-C，D）。

2.2 白啄瓜Fom-2基因編碼蛋白分析

采用ProtScale在線分析（http://www.expasy.org/tools/protscale.html）表明，FOM-2蛋白具有多個高疏水性和親水性區域（圖版-E）。通過SWISS-MODEL分析表明FOM-2蛋白具有典型螺旋及折疊結構，含有一個可能的CC區域，可能屬于CC-NBS-LRR類型R基因（圖版-F）。

基于白啄瓜推定的氨基酸序列及NCBI數據庫中典型的R基因序列，采用MEG4.0軟件已鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹，表明白啄瓜Fom-2基因與其他物種的NBS-LRR類R基因同源性較高（圖1）。

2.3 枯萎病接種后白啄瓜Fom-2基因的表達

采用實時熒光定量PCR方法，對白啄瓜Fom-2基因的表達情況進行了研究，結果表明，白啄瓜Fom-2基因在經甜瓜枯萎病生理小種1接種后表達明顯上調，接種后表達水平相對于對照水平上升7倍左右（圖2）。

3 討 論

抗枯萎病育種是甜瓜等瓜類作物的主要育種目標之一，枯萎病抗性基因的克隆為抗病分子育種提供依據。高等植物中廣泛存在相對保守的植物抗病基因R基因，其中NBS-LRR（nucleotide binding site-leucine rich repeat）類R基因是數量最多的一類含有核苷酸結合位點及富含亮氨酸重復的胞內受體蛋白[8]。模式植物擬南芥基因組中大約有200個左右的R基因類似序列，但功能已知的只有少數十幾個[9]。本研究通過同源克隆方法從薄皮甜瓜白啄瓜中克隆到了抗甜瓜枯萎病生理小種0和1的Fom-2基因的同源基因，從白啄瓜中克隆到的Fom-2基因與NCBI數據庫中已注冊的NBS-LRR類R基因具有較高同源性，為典型的NBS-LRR類R基因，具有R基因的2個結構功能域NB-ARC及富含LRR域的SCOP結構功能域[8]。目前認為，LRR區域為病原菌的特異識別區域，單核苷酸改變都有可能影響到病原菌的專性識別，LRR區域的專性識別機制是植物抗病基因與病原菌協同進化選擇的結果[10]。我們同時也對不同甜瓜變種或栽培種的Fom-2基因LRR區域進行了擴增與分析，發現了LRR區域在不同甜瓜變種或栽培種中存在單核苷酸多態性，我們同時也根據這些單核苷酸多態性位點開發了AS-PCR及CAPS標記，用于甜瓜抗枯萎病分子育種輔助選擇[11]。國內有課題組曾從 日本安農二號（Japan annong-2）甜瓜中克隆到了Fom-2基因，同時也研究了幾個甜瓜品種中該基因的單核苷酸多態性位點，為甜瓜的抗枯萎病育種提供理論依據[12-13]。然而，目前Fom-2基因介導甜瓜抗甜瓜枯萎病生理小種0和1的機制仍不清晰，FOM-2蛋白的生化機制及LRR區域單核苷酸多態性位點與基因的功能相關性研究目前仍需要進一步深入。隨著更多甜瓜Fom-2基因的克隆與分析，大大加快了甜瓜抗枯萎病的分子育種進程。（本文圖版見插4）

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