尼莫地平對AD大鼠腦組織NO的影響

[摘要] 目的 探討尼莫地平改善癡呆大鼠模型學習記憶能力的機制。方法 隨機將30只大鼠分為三組，空白對照組不作處理，模型組和尼莫地平組用Aβ25～35腦海馬注射造模，尼莫地平組給予尼莫地平干預。2周后進行迷宮實驗，比較各組大鼠行為上的差異。3周后腦組織NO檢測，進行組間比較。結果 尼莫地平組學習記憶能力優于模型組，三組腦組織NO含量，經方差分析有顯著性差異(P<0.01)。結論 尼莫地平能改善癡呆大鼠模型的學習和記憶能力，這種改善可能與維持Ca2+穩態、保護腦組織、減少NO等神經毒損害有關。

[關鍵詞] 阿爾茨海默病; 尼莫地平; 一氧化氮

[中圖分類號] R749.16 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)07-05-03

Effect of Nimodipine on AD Rat Brain Tissue NO

GAO Lu1 WANG Chaowei1 HU Weimin2

1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China;2.Department of Neurology，the Second Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] ObjectiveTo explore the mechanism of whether nimodipine can improve learning and memory in dementia rat model. Methods Thirty rats were randomly divided into three groups:control group with no treatment，the model group and nimodipine group. The dementia rat model was established by injection of brain hippocampus Aβ25～35，and the nimodipine group was given nimodipine intervention. The maze test was carried out after two weeks and the comparison was made of the differences in rat behavior of the three groups. The brain tissue NO content was detected after three weeks and the comparison was made in the three groups. ResultsBoth learning and memory of the nimodipine group were better than those of the model group. The NO content in the brain tissue of the three groups was detected，and the analysis of variance showed a significant difference(P<0.01). ConclusionNimodipine can improve learning and memory of dementia rat，which may be related to the maintenance of Ca2+ homeostasis and protection of brain tissue，such as reduction of NO neurotoxicity damage.

[Key words]Alzheimer disease; Nimodipine; NO

1994年Khachaturian提出了阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的鈣穩態學說[1]，認為細胞Ca2+ 濃度的持續升高會導致神經細胞損傷和凋亡。細胞培養和動物實驗證明，Ca2+穩態失衡與AD病理特點有關[2]。高Ca2+可活化氧化氮合酶，產生NO。NO是一種自由基，在中樞神經系統參與多種病理和生理作用。實驗證明，海馬內NO的表達和學習記憶密切相關。血管性癡呆時腦脊液中NO濃度與癡呆程度呈正相關。尼莫地平(NIM)是二氫吡啶類鈣拮抗劑，動物實驗證明，它能增加動物的探究行為、改善學習記憶功能。本實驗用NIM干預過的AD大鼠模型進行行為學和NO含量的對照研究，以證明鈣穩態學說和NIM的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康Wistar雄性大鼠30只，月齡5，由山西醫科大學實驗動物中心提供，體重200～250g。

1.1.2 藥物 尼莫地平片由天津市中央藥業有限公司生產，批準文號:國藥準字H20043915。

1.1.3 試劑 Aβ25～35溶液，由Sigma公司生產;NO試劑盒由南京建成科技有限公司生產。

1.1.4 主要儀器 大鼠腦立體定位儀、顱骨鉆，由淮北正華生物儀器有限公司生產;Morris迷宮，由中國醫學科學院藥物研究所生產。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥方法 實驗大鼠隨機分為空白對照組、模型組與尼莫地平組，每組10只，模型組和尼莫地平組制作成AD模型，尼莫地平組給予NIM 10mg/(kg·d)灌胃，連用3周。

1.2.2 造模方法 模型組與尼莫地平組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，參考大鼠腦立體定位圖譜，將大鼠的頭固定在立體定位儀上，剪去局部毛發，消毒后沿矢狀線切開皮膚約1.5cm，暴露顱骨，確定海馬區注射點(前囟后3mm，中線旁開2mm)，用顱骨鉆在顱骨上打孔，用微量注射器沿穿刺孔垂直進針3.5mm，緩慢注射Aβ25～35溶液5μg，5min內注射完，留針5min，拔針后牙科泥封住穿刺孔，術區滴慶大霉素，縫合皮膚并消毒。肌肉注射青霉素10萬U/d，連續3d，防止感染。

1.2.3 Morris迷宮 造模前1周大鼠進行Morris迷宮訓練，取第6天游迷宮所需時間與造模后第1次游迷宮時間進行對照，數據見表1。造模2周后，再進行迷宮實驗，逐一記錄每只大鼠從3個遠象限入水到找到平臺所需的時間，合計后取各組均值，連續記錄6d，數據見表1。

1.2.4 檢測指標及過程 造模3周后，斷頭取腦。用組織勻漿器充分研磨，生理鹽水稀釋，2500r/min，離心5min，取上清液，置-20℃冰箱中備檢。按NO測定試劑配置要求，用分光光度計檢測和計算NO含量。數據見表2。

1.2.5 統計學處理 采用SPSS13.0進行統計學分析，實驗數據用均數±標準差表示。經檢驗，該資料滿足方差分析的條件，因此，采用方差分析進行分析。

2 結果

2.1 造模前、后游迷宮所需時間

造模前游迷宮所需時間為(25.19±9.35)s，造模后游迷宮所需時間(159.22±16.24)s。實驗結果顯示，造模前后游迷宮所需時間有明顯差異(t=2.967，P<0.01)，差異有統計學意義，證明造模成功。

2.2 三組游迷宮所需時間

見表1。實驗結果顯示，模型組學習記憶力下降，表現為游至安全平臺時間最長，與空白對照組及尼莫地平組比較差異有顯著性，而且隨著訓練次數增加，差異更加明顯。第6天F=86.78(P<0.05)，實驗證明NIM對記憶功能有增強作用。

2.3 各組NO指標分析

見表2。NO指標三組經方差分析，F=79.302，差異有統計學意義(P<0.01)。進一步采用LSD-t的方法進行兩兩比較，空白對照組與模型組比較t=3.963，尼莫地平組與模型組比較t=2.831，尼莫地平組與空白對照組比較t=2.922，結果差異均有統計學意義(P<0.01)。

3 討論

Ca2+是重要的細胞內信使之一，對神經發展、突觸傳遞和可塑性及各種代謝途徑調控也至關重要[3]。進入老年，神經細胞Ca2+調節系統功能出現紊亂，細胞內Ca2+濃度升高、Ca2+內流增加、線粒體緩沖Ca2+的能力下降等[4]。Ca2+失衡的原因除與年齡有關外，與基因突變、Aβ、谷氨酸、NO等錯綜聯系。對早老基因(PS)研究，PS促成內質網Ca2+通道形成和增加通道的滲透性，還影響1，4，5三磷酸肌醇受體(IP3R)[5]，實驗證明Ca2+進入細胞質主要是通過IP3R途徑實現的。IP3R是存在于內質網、肌漿網及核膜上的一種配體門控Ca2+通道蛋白，精確地調控胞漿內Ca2+濃度的變化。風險基因研究發現，增加CALHM1蛋白在細胞膜和內質網質膜表達，也可增加Ca2+進入細胞和提高細胞內Ca2+濃度[6]。高Ca2+能調節β-淀粉樣蛋白前體(APP)的加工，增加Aβ的生成和毒性作用;另一方面，Aβ能嵌入細胞膜，形成Aβ通道，通過調節細胞膜離子通道，破壞細胞離子穩態，加劇Ca2+失衡，導致氧化應激、線粒體損傷、突觸功能障礙，高Ca2+還可促進Tua蛋白過度磷酸化。中樞神經系統中谷氨酸水平過高可導致NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受體的過度激活，從而細胞內敏感的細胞器，如線粒體、內質網內Ca2+積聚，阻止Ca2+從內質網流到線粒體或者緩沖細胞內Ca2+，可減少凋亡刺激的敏感性。所以說Ca2+失衡是腦老化和AD的關鍵。NO有擴張血管、抑制血小板聚集與黏附、炎癥介質等作用，還是重要的信號傳遞物質。過高的NO被認為可促使炎癥細胞功能紊亂和神經系統疾病，在神經退行性疾病時生成增多被看作氧化應激的后果[7]。Ca2+內流增加，活化氧化氮合酶，產生過多的NO。NO再分解成亞硝酸鹽(ONOO-)，這是一種高活性的氧自由基物質，可引起DNA氧化損傷，還可與某些含亞鐵原卟啉基因的鐵原子結合，形成亞硝酸鐵絡合物，從而抑制線粒體呼吸作用[8]。

綜上所述，減少Ca2+內流可以減少NO的過多生成及降低其他病理過程的風險，起到腦保護作用。一些AD患者應用左旋電壓門控制Ca2+通道(L-VGCCS)阻滯劑，提高了學習和記憶能力，這說明AD神經變性與鈣通道有關[9]。本實驗思路就是使用NIM減少Ca2+內流，探討Ca2+與NO的關系。NIM易透過血腦屏障，海馬、皮質、丘腦等結構，含有高密度的二氫吡啶結合部位，所以NIM可能對AD的治療作用更優于其他類鈣拮抗劑。實驗中尼莫地平組在Morris迷宮中找到平臺的時間優于模型組，而且隨著訓練次數的增加，這種優勢更加明顯。NO含量測定，尼莫地平組數值介于空白對照組和模型組之間，一方面說明NIM通過維持Ca2+穩態，減少了NO的生成，有利于AD的恢復;另一方面腦NO測定結果與迷宮實驗結果平行，說明腦NO含量變化與AD大鼠學習記憶能力有關。空白對照組含量最低，說明NO含量只有在一定水平時才能發揮生理作用;模型組含量最高，說明過高的NO含量具有神經毒作用，不利于AD的恢復。

[參考文獻]

[1] Lukasz Bojarski，Jochen Herms，Jacek Kuznicki. Calcium dysregulation in Alzheimer’s disease[J]. Neurochemistry International，2008，52:621-633.

[2] Behnam Sabayana，Mohammad Reza Namazi，Arash Mowla，et al. Are patients with Darier and Haily-Haily diseases susceptible to Alzheimer’s Disease?a Theory based on abnormal intraneuronal Ca2+ homeostasis[J]. Journal of Alzheimer’s Disease，2009，16:521-523.

[3] Antonio Pisani，Paola Bonsi，Paolo Calabresi. Calcium signaling and neuronal vulnerability to ischemia in the striatum[J]. Cell Calcium，2004，36(3-4):277-284.

[4] Ilya Bezprozvanny，Mark PM. Neuronal calcium mishandling and the pathogenesis of Alzheimer’s disease[J]. Trends Neurosci，2008，31(9):454- 463.

[5] David HS，Robert Gasperini，Adele JV，et al. The role of Aβ-induced calcium dysregulation in the pathogenesis of Alzheimer’s disease[J]. Journal of Alzheimer’s Disease，2009，16(2):225-233.

[6] Rudolph ET，Lars Bertram. Alzheimer's disease:the latest suspect[J]. nature，2008，454(7205):706-708.

[7] Xiao-xia DONG，Yan WANG，Zheng-hong QIN. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases[J]. Acta Pharmacol Sin，2009，30(4):379-387.

[8] Ana Navarro，Alberto Boveris. The mitochondrial energy transduction system and the aging process[J]. Am J Physiol Cell Physiol，2007，292(2):670-686.

[9] Rukhsana Sultanaab，D Allan Butterfield. Alterations of some membrane transport proteins in Alzheimer’s disease:role of amyloid β-peptide[J]. Molecular Bio Systems，2008，4(1):36-41.

(收稿日期:2009-10-10)