表皮生長因子及其受體在腋(臭)區頂泌汗腺中的表達及臨床意義

[摘要]目的:研究表皮生長因子(EGF)及其受體(EGFR)在腋(臭)區頂泌汗腺細胞中的表達情況及其臨床意義。方法:采用免疫組織化學方法(S-P法)檢測腋臭患者和正常人腋區頂泌汗腺細胞中EGF 和EGFR的表達水平。利用計算機圖像分析技術測量腋臭患者和正常人腋區頂泌汗腺細胞EGF 和EGFR表達的平均光密度。結果:①EGF在腋臭患者頂泌汗腺組織中的表達顯著高于正常人(P<0.01);②EGFR在腋臭患者頂泌汗腺組織中表達顯著高于正常人(P<0.01)。結論:EGF 和EGFR在腋(臭)區頂泌汗腺細胞中的表達水平的增加與腋臭的發病有著密切關系。

[關鍵詞]EGF;EGFR;腋臭;免疫組化

[中圖分類號]R758.74[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)10-1490-03

Expression of EGF and EGFR in apocrine glands of human axillae in osmidrosis

XIE Qun1，SHAN Sheng-guo2，SUN Wen-tao3，LIU Xuan3

(1.Department of Plastic Surgery，the Central Hospital of Xiangfan，Xiangfan 441021，Hubei，China; 2.Department of Plastic Surgery，the Renmin Hospital，Wuhan University;3.Department of Plastic Surgery，the Fisrt Hospital of Yichang)

Abstract: ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of EGF and EGFR in apocrine glands from human axillae of osmidrosis.MethodsThe immunohistochemical S-P method was used to examine the expression of EGF and EGFR of apocrine glands from osmidrosis patient and health adult. Image analysis system was applied to measure the expression level of EGF and EGFR of apocrine glands from human axillae of osmidrosis and health adult.Results①The expression of EGF in apocrine glands of experimental group were found significantly higher than control group (P<0.01);②The expression of EGFR in apocrine glands of experimental group were found significantly higher than control group (P<0.01).ConclusionThe increasing level of EGF and EGFR are maybe related to the pathognesis of osmidrosis.

Key words: EGF; EGFR; osmidrosis; immunohistochemistry

腋臭癥( axillary osmidrosis ) 是由腋窩頂泌汗腺(大汗腺)產生的分泌物，排出體外后經細菌分解，產生一種難聞的氣味，嚴重者影響患者的社會人際交往。EGF具有多種生物學活性和豐富的臨床應用前景。EGF存在于人體的許多組織中，特別是腺體細胞中。EGF與靶細胞膜上的受體結合后，通過直接誘導磷酸化從而介導各種信號轉導途徑來發揮生物學效應[1]。在復雜的機體物質代謝過程中，推測EGF和EGFR介導的磷酸化過程可能在膽固醇和脂肪酸合成過程中起到調控作用。為了進一步探討腋臭的發病機制，本研究采用免疫組化和圖像分析的方法對EGF和EGFR在腋臭患者腋區頂泌汗腺組織中的表達情況進行了半定量研究。

1材料和方法

1.1 實驗對象:實驗組:取2007年3月～2007年8月進行手術治療腋臭的患者40例，其中女性30例，男性10例，中位年齡25.2(16～38)歲。對照組:同期行腋部切口隆乳手術的患者10例，均為女性，中位年齡 28.7(26～34)歲。

1.2 方法:獲取試驗對象腋區皮膚及皮下汗腺組織，處理、固定標本，制作來源于同一標本不同部位的頂泌汗腺的蠟塊、制備切片，石蠟切片常規脫蠟、水化后用PBS沖洗，過氧化物酶阻斷劑封閉內源性過氧化物酶活性，加入一抗，室溫孵育，加生物素標記的第二抗體，加鏈霉親和素的過氧化物酶溶液，孵育后滴加DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、封壓。按照隨機化的原則，取其中1個部位的切片相對應的組織塊作為免疫組織化學染色的目標對象。

1.3 試劑:濃縮型鼠抗人EGF多克隆抗體、濃縮型鼠抗人EGFR多克隆抗體以及免疫組化試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 結果判定:在200×光鏡下，運用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統，對EGF和EGFR抗原在腋區頂泌汗腺細胞中的表達進行半定量分析。每張切片隨機選取5個完整且不重疊的視野行定量分析，測定每個視野下陽性反應的平均光密度。以每例5個視野的平均光密度的平均值作為該例的測量值。

1.5 統計學分析:測量數據均以均數±標準差(x±s)表示，利用SPSS13.0統計分析軟件對EGF和EGFR的實驗結果進行t檢驗，以P<0.05為有統計學意義。

2結果

2.1組織學觀察:在光鏡下觀察腋區頂泌汗腺HE染色的標本可見，通過比較同一標本不同視野下頂泌汗腺細胞后，發現分泌細胞呈現柱狀、立方和扁平形態，其胞核的形態及胞漿中嗜酸性分泌囊泡(顆粒)的數量有不同。柱狀細胞的頂部可見有大量明顯嗜酸性小囊泡聚集，部分細胞頂部的分泌物形成較大的圓球狀結構凸向管腔;立方細胞的嗜酸性小囊泡的數量較柱狀細胞中的數量明顯為少，在細胞的頂部未見有圓球狀結構形成;扁平細胞的胞質很少，未見有嗜酸性小囊泡分布或僅見極少量囊泡分布其中。

本實驗中，每種類型的頂泌汗腺所占的比例是不一樣的。在試驗組觀察到頂泌汗腺的腺腔呈圓形或略不規則形，以柱狀細胞構成的為主，扁平細胞和立方細胞較少，(圖1)。而在對照組中以扁平細胞和立方細胞構成的頂泌汗腺相對較多，柱狀細胞很少，腺腔呈不規則形(圖2)。

2.2 EGF的表達:EGF的陽性定位主要位于頂泌汗腺細胞的胞漿中，表現為細胞胞漿中有棕黃色顆粒沉積。試驗組胞漿中可見大量的棕黃色顆粒沉淀，EGF表達較強。健康對照組胞漿中棕黃色顆粒沉淀較少，EGF表達弱或不表達。2組之間的EGF平均光密度差異具有統計學意義P<0.01(見表1)。

2.3 EGFR的表達:EGFR的陽性定位主要位于頂泌汗腺細胞的細胞表面，表現為細胞表面棕黃色顆粒分布。試驗組細胞表面可見大量的棕黃色顆粒沉淀，EGFR表達較強。對照組細胞表面棕黃色顆粒沉淀較少，EGFR表達弱或不表達。兩組之間EGFR的平均光密度差異具有統計學意義P<0.01(見表1)。

3討論

腋臭的確切病因尚不明確，研究發現剛排出皮膚表面的大汗液呈乳白色，沒有臭味，排出后不久受到腋窩潮濕部位細菌(表皮葡萄球菌、格蘭氏陰性桿菌等) 的分解，才發出典型的令人厭惡的臭味。Zeng等[1]通過氣相色譜/質普法檢測發現，腋臭的氣味系由C6-C11的不飽和支鏈脂肪酸所致，主要是(E)-3-甲基-2-己烯酸(E-3-methyl-2-hexenoic acid，E-3M2H)分子。James等[2]研究發現類白喉桿菌在腋臭的形成中有調控作用，較其它常見皮膚菌群作用大。

隨著研究工作的深入，頂泌汗腺細胞的生理及病理功能方面的研究得到越來越多的重視。頂泌汗腺雖然在出生時就存在，但是直到青春期才表現其分泌功能。頂泌汗腺細胞的分化、增值和結構形成受多種基因和因子的調控，推測頂泌汗腺細胞的功能異?？赡芘c這些調控因子的變化有密切關系。Pesonen等[3]首次報道EGF在腋窩頂泌汗腺液中的存在，證實了頂泌汗腺比外分泌汗腺含有的EGF的量更多(可達50倍) 。EGF存在于人體的許多組織中，特別是腺體細胞中。EGF因其具有多種生物學活性和豐富的臨床應用前景，成為近年來生物化學研究的熱點之一。Saga等[4]通過比較人類外分泌和頂泌汗腺中EGF的表達方式，證實了EGF分布在汗腺的分泌部，并且頂泌汗腺分泌細胞比外分泌汗腺分泌細胞具有更強的反應性。免疫電鏡下顯示頂泌汗腺分泌細胞內線粒體樣小顆粒中抗EGF抗體呈陽性反應，推測EGF的作用機制是由汗腺中的分泌細胞產生的EGF控制分泌細胞自己的增殖和功能[5];由于導管細胞抗EGF陰性反應，說明導管細胞不能產生EGF，但其EGF受體可以通過接受汗液中EGF的活化，并影響著導管細胞的增殖和功能。EGF在肌上皮細胞中的生理作用知之甚少，Schon M等[6]認為肌上皮細胞在外分泌和頂漿汗腺中不表達EGF受體， 但有報道認為在加入EGF的培養基中肌上皮細胞具有向上皮和間質選擇性分化的潛能。

EGF能夠發揮作用是于其受體密不可分的。EGFR存在于人體除造血系統外的幾乎所有組織中。EGF是與靶細胞膜上EGFR結合后發揮生物學效應的。二者的結合具有高親和力、時間與溫度的依賴性、飽和性和可逆性。研究發現，EGFR與核內染色體相連，可通過直接誘導特殊核蛋白的磷酸化而發揮其生理功能。EGF首先與EGFR的胞外結合部位結合，導致受體分子發生二聚化，促使EGFR羧基末端的三個酪氨酸殘基(Tyr)自身磷酸化位點發生磷酸化，使受體酪氨酸激酶活化，從而磷酸化受體本身及下游的信號分子，磷酸化的受體通過其磷酸化酪氨酸殘基可與蛋白質的SH2結構域相互作用，結合胞內的信號轉導分子。已知EGFR的活化可以使細胞內三磷酸肌醇和二?；视驮龆啵Y果引起細胞內游離鈣離子增多，激活磷酸蛋白激酶C和磷酸蛋白激酶A，從而介導各種信號轉導途徑，使細胞增殖和功能發生改變。

英國[7]有研究利用離體人類皮膚附屬器對膽固醇和脂肪酸生物合成過程中的兩種重要催化酶，即3-羥基-3-甲酸戊二酰基輔酶A(HMG-CoA)還原酶和乙酰CoA羧化酶分別進行測定，發現HMG-CoA還原酶和乙酰CoA羧化酶均可以通過磷酸化失活。說明磷酸化和外源性膽固醇可調節人類頂泌汗腺、皮脂腺和毛囊內的HMG-CoA還原酶和乙酰CoA 羧化酶的活性。在復雜的物質代謝過程中，推測EGF和EGFR介導的磷酸化過程可能在膽固醇合成過程中，起到調節作用。

Spielman等[8]研究發現:3M2H是伴隨分子量分別為45和26kDa的兩種分泌物載體蛋白而分泌到皮膚表面。而這兩種蛋白質，也就是所謂的頂漿汗腺分泌物偶聯蛋白(ASOB1和ASOB2)。Natsch等[9]研究發現:3M2H在胞漿中同ASOB2分子的N-末端的谷氨酰胺殘基，首先以共價鍵結合在一起的，到達皮膚表面被特異性的棒狀桿菌的酶，即Nα-?；劝滨０钒被；阜纸夂?，以非共價鍵的形式同ASOB2結合，最終導致了臭味氣體緩慢地產生。Natsch等[10]通過鑒定一連串可揮發性脂肪酸，發現形成復合氣味的不同的酸都是與Gln以肽鍵連接在一起的。EGF能夠通過提高谷氨酰胺酶和谷氨酰胺合成酶的活性，增加組織中谷氨酰胺的合成、攝取即利用。

綜上所述，通過以上研究我們發現:腋臭患者頂泌汗腺組織中EGF和EGFR的表達明顯高于正常人，提示EGF和EGFR在腋臭的發生、發展過程中具有一定的意義。我們推測可能是當EGF與EGFR結合后，誘導頂泌汗腺細胞中分泌物合成相關基因的表達能力增強，使細胞明顯肥大，促進E-3M2H等揮發性物質合成增多，在以apoD蛋白作為載體的協助下，運送揮發性物質分泌到皮膚表面。后經過寄生于皮膚表面的細菌(棒狀桿菌、葡萄球菌)的分解作用，使E-3M2H等揮發性物質被釋放出來。然而，迄今為止，對腋臭發病機制的研究剛剛起步，有大量的問題有待今后進一步深入的基礎和臨床研究。

[參考文獻]

[1]Zeng XN，Leyden JJ，Brand JG，et al，An investigation of human apocrine gland secretion for axillary odor precursors[J].J Chem Ecol，1992，18:1039-1055.

[2]James AG，Casey J， Hyliands D，et al，Fatty acid metabolism by cutaneous bacteria and its role in axillary malodour[J].World J Microbiol Biotechnol，2004，20:787-793.

[3]PesonenK，ViinikkaL，KoskimiesA，et al.Size heterogeneity of epidermal growth factor in human body fluids[J].Life Sci，1987，40:2489-2494.

[4]SagaK，Jimbow K.Immunohistochemical localization of activated EGF receptor in human eccrine and apocrine sweat glands[J]. J Histochem Cytochem，2001，49 (5):597-602.

[5]陳偉，付小兵，孫同柱，等. 表皮細胞生長因子及其受體在胎兒皮膚組織內的表達特征及其意義[J].中國臨床康復，2002，6(8):1128-1133.

[6]Schon M，Benwood J，O 'Connell-Willstaedt T，et al. Human sweat gland myoepithelial cells express a unique set of cytokeratins and reveal the potential for alternative epithelial and mesenchymal differentiation states in culture[J]. J Cell Sci，1999，112(Pt12):1925-1936.

[7]Smythe CD，Greenall M，Kealey T. The activity of HMG-CoA reductase and acetyl-CoA carboxylase in human apocrine sweat glands，sebaceous glands，and hair follicles is regulated by phosphorylation and by exogenous cholesterol[J]. J Invest Dermatol，1998， 111(1):139-148.

[8]Spielman AI，Zeng XN，Leyden JJ，et al. Proteinaceous precursors of human axillary odor: isolation of two novel odor-binding proteins[J].Experientia，1995，51: 40-47.

[9]Natsch A，Gfeller H，Gygax P，et al. A specific bacterial aminoacylase cleaves odorant precursors secretedin the human axilla[J].J Biol Chem，2003，278:5718-5727.

[10]Natsch A，Derrer S，Flachsmann F，et al. A broad diversity of volatile carboxylic acids， released by a bacterial aminoacylase from axilla secretions，as candidate molecules for the determination of human-body odor type[J].Chem Biod， 2006，3(1):1-20.

[收稿日期]2010-06-26 [修回日期]2010-09-25

編輯/張惠娟