牛源糞腸球菌的分離鑒定及藥敏試驗

腸球菌屬(Enterococcus)細菌為兼性厭氧的革蘭氏陽性球菌，是人、犬、禽、豬、馬等動物胃腸道正常菌群之一，也廣泛分布于土壤、水和食物中。長期以來被認為致病力較低而未引起重視，但近年來，腸球菌屬條件致病菌所致感染的發生率持續升高，尤其在原有嚴重基礎疾病及機體免疫力降低時，極易侵入體內或易位，導致局部或全身重癥感染，給臨床治療帶來困難。

１材料與方法

１.1材料

１.1.1糞 樣

選自黑龍江墾區某農場的40頭健康荷斯坦泌乳牛，采集其新鮮糞便作為試驗材料。

１.1.2培養基

血平板、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、普通營養瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、葡萄糖肉湯、營養肉湯、生化鑒定管等均購自廣東環凱生物科技有限公司。

１.1.3試驗動物

18～26 g健康的小白鼠。

１.2方法

１.2.1糞樣的采集

肛門式采集。用無菌橡膠手套直接從試驗牛的肛門采集新鮮糞樣，分別裝入無菌藍蓋試劑瓶中，立即送實驗室4 ℃保存備用。

１.2.2細菌的分離鑒定

１.2.2.1細菌的分離純化培養

將新鮮糞樣接種于葡萄糖肉湯中，置37℃，18～24h，進行增菌培養。再將肉湯培養物接種到KF鏈球菌瓊脂上，置37℃，培養24h。將可疑菌落進行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。并接種于胰蛋白胨大豆瓊脂、營養瓊脂、血平板、麥康凱瓊脂和葡萄糖肉湯、營養肉湯培養基中，置37℃培養18～24h，觀察菌落生長狀況。觀察細菌生長狀況以及菌落形態特征，并將其進一步純化培養。將所得純培養物置胰蛋白胨大豆瓊脂斜面保存備用。

１.2.2.2觸酶試驗

從固體培養基上挑取1接種環待檢菌，置于潔凈玻片上，再滴加3%過氧化氫一大滴，立即觀察結果。在30s內產生大量氣泡者為陽性，不產生氣泡者為陰性。

１.2.2.3溶血試驗

用平板法測定分離菌的溶血特性，即取分離菌接種于血平板上，于37℃培養24 h后觀察菌落周圍溶血現象。若菌落周圍出現溶血環（完全溶血），或出現草綠色溶血環（不完全溶血）為陽性。若菌落周圍無溶血現象為陰性。

１.2.2.4細菌的生化鑒定試驗

將所得菌落葡萄糖肉湯培養物分別接種于各種微量生化鑒定管 ，經37℃培養24 h～48 h后觀察結果。

１.2.3動物試驗

從35株分離菌中隨機抽取20株，取其37℃、18～24h葡萄糖肉湯培養物，以0.5ml/只的劑量，分別進行小白鼠腹腔注射，每種細菌做2個重復及無菌葡萄糖肉湯作對照。接種后的小白鼠在同樣條件下隔離飼養，觀察24h內的發病死亡情況，對死亡或發病明顯者立即進行剖檢，取發病小白鼠的心、肝組織涂片、鏡檢，若與注入細菌相同，則判定此菌為病原菌。對未見發病的小白鼠繼續觀察1周。

１.2.4藥敏試驗

取各中草藥50g，加5～10倍蒸餾水浸泡30 min后煎煮，武火加熱至沸后文火維持30 min，用4層紗布過濾，濾出煎液，濾渣按上述方法再煎煮1次，合并2次濾液，濃縮至生藥含量1g/ml，然后1000r/min離心10 min，取上清液，100℃水浴滅菌10 min后，置4℃冰箱中保存備用。

采用牛津杯法。分別加入100 μL藥液于已制備好的帶有菌層的平皿中的牛津杯內，蓋好，37℃培養24 h，測量抑菌圈直徑，當直徑在10mm～15mm之間為敏感，大于15mm為高敏感。

２結果與分析

２.1細菌形態

經革蘭氏染色后鏡檢，可見革蘭氏陽性球菌，圓形或卵圓形，成雙或鏈狀排列，無鞭毛、無芽孢、無莢膜。

２.2細菌分離

從40份樣品中，分離到35株革蘭氏染色陽性、球形、能夠排列成鏈狀、過氧化氫酶試驗陰性的細菌。分菌率為87.5%。

２.3酶酶試驗

取可疑菌落置于潔凈玻片上，滴加一滴3%過氧化氫，見無氣泡冒出，故分離菌株觸酶試驗為陰性。

２.4溶血試驗

取分離菌接種于血平板上，于37℃培養24 h后觀察到近2/3菌株其菌落周圍無溶血現象，而近1/3菌株其菌落周圍出現1～2mm寬的草綠色溶血環。說明多數菌落溶血試驗呈陰性，少數呈陽性。

２.5動物試驗

小白鼠接種糞腸球菌18～24h葡萄糖肉湯培養液后觀察2d，發現接種細菌的小白鼠在48 h內有死亡發生，死亡率為13/40。剖檢死亡小白鼠可見肝臟充血，出血，腸管鼓氣。未死亡的小白鼠均表現出不同程度發病，如精神萎靡，采食減少，不愿走動等。將未死亡小鼠繼續觀察至1周，撲殺后剖檢其內臟器官未見明顯的病變。而對照組的小白鼠均很正常。從以上發病或死亡小白鼠的脾臟、肝臟和心臟等部位均能分離到原接種細菌。

３討論

糞腸球菌的分離與鑒定

糞腸球菌是人類和動物腸道正常菌群的成員，通常在引起腹腔和盆腔感染所分離的混合菌中發現，以往認為糞腸球菌是對人類無害的共棲菌，但近年研究已證實了腸球菌的致病力。在需氧革蘭氏陽性球菌中，它是僅次于葡萄球菌的重要醫院內感染致病菌。糞腸球菌不僅可引起尿路感染、皮膚軟組織感染，還可引起危及生命的腹腔感染、敗血癥、心內膜炎和腦膜炎等。本研究從呼和浩特市某奶牛場40頭健康荷斯坦泌乳牛的新鮮糞樣中共分離出35株疑似糞腸球菌，經細菌培養特征、形態染色特性、觸酶試驗、溶血試驗以及生化鑒定等試驗結果表明，所分離出的菌株均屬糞腸球菌，分離率為87.5%。同時從動物致病性試驗結果可知，所分離到的糞腸球菌均能引起小白鼠不同程度發病，死亡率為32.5%。說明糞腸球菌既是人和動物腸道中的正常菌群，也是畜禽糞便污染所帶來的重要病原菌。其致病力不是很強，但常可引起抵抗力低下宿主的多種機會感染。

牛糞作為腸球菌的主要定殖場所，其有效處理不僅降低致病性腸球菌以及其它病原微生物的傳播，還可減少環境污染、降低疾病蔓延，對公共衛生具有重大意義。

（作者單位：156511黑龍江省撫遠縣前哨農場畜牧科、撫遠縣前哨農場獸醫站）