山東主栽杏品種分子遺傳多樣性研究

摘要：利用熒光AFLP標記技術，對26個山東省主栽杏品種的遺傳多樣性進行研究。結果表明：8對AFLP引物平均擴增出103.25條多態性帶，多態性百分比為87.37％。所有檢出位點的平均Nei’s基因多樣度為0.1935，平均香農信息指數為0.3100，說明山東杏遺傳多樣性較為豐富。在相似系數58.58％處將山東主要栽培杏分為四大類，四大類中都有I山東本地杏的分布。其中玉巴旦、大麥黃和楊繼元品種同山東其它杏品種及美洲杏遺傳距離較遠，因此這3個品種對于擴大山東栽培杏遺傳多樣性，進行新品種培育和種質創新具有重要意義。

關鍵詞：山東栽培杏；AFLP標記；遺傳多樣性

中圖分類號：S662.203

文獻標識號：A

文章編號：1001—4942(2010)11—o006—04

杏原產我國，全世界約有3000余個杏品種。在山東省，經過長期的人為選擇和大量的引種、育種工作，形成了一些山東省的主栽品種，如泰安的巴旦水杏，濟南的紅荷包，青島的關爺臉、楊繼元等古老的山東杏栽培品種，對山東杏產業的發展做出了重要的貢獻。但由于其自花不實，花粉敗育，極大地影響了產量，因此，近年來從美國等國家引進了凱特、金太陽等自花結實、豐產性強的品種，逐漸成為山東的主栽品種，與山東本地品種共同構成了山東的杏產業。

遺傳多樣性是保護生物學及遺傳育種的重要基礎。與RFLP、RAPD、SSR等分子標記技術相比，AFLP分子標記技術具有多態性高、重復性好等特點，已在梨板栗和石榴等果樹種質資源的遺傳多樣性分析中被廣泛應用。因此，利用熒光AFLP分子標記技術對杏栽培品種親緣關系進行分析，意義重大。吳樹敬等采用RAPD技術對20個杏品種的遺傳多樣性進行了分析，RFLP和SSR等標記技術也廣泛用于普通杏遺傳多樣性的分析，苑兆和等利用熒光AFLP技術對普通杏和南疆杏品種的群體遺傳結構進行了分析，但山東地區栽培杏品種的遺傳多樣性還未見相關分析報道。本試驗采用熒光AFLP標記技術對山東主要栽培杏品種的遺傳多樣性進行分析，旨在為山東杏品種選育與種質創新的親本選擇提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本試驗于2009年在山東省果樹研究所觀賞園藝學實驗室進行，供試26個山東主栽杏品種(表1)均采自山東省果樹研究所杏資源圃，2009年5月分別取其幼葉立即放人裝有干燥硅膠的自封塑料袋中干燥備用。

1.2 基因組DNA提取

采用CTAB法并稍加改進。稱取材料各0.1g，液氮研磨3—4次，將粉末倒入裝有800μl提取緩沖液[1×CTAB提取緩沖液：50mmol／Lriffs—Cl(pH8.0)，10mmol／LEDTA，0.7mmol／L NaCl，1％(W／V)CTAB，20mmol／L巰基乙醇]的2ml離心管中，加入60μl巰基乙醇混勻，60℃預熱30min，期間混勻2—3次，取出樣品于室溫放置，待樣品冷卻到定溫后加入800μl氯仿：異戊醇(24，1)，振蕩混勻，12000 r／min離心15min，取上清到一新2ml離心管中，加入1.5倍CTAB[50mmol／L Tris—cl(pH8.0)，10mmol／L EDTA，1％(W／V)CTAB，20mmol／L巰基乙醇]，放置20—30min，12000r／min離心15min，將沉淀晾干，溶于200μl TE—buffer，加入400μl95％乙醇和20μl NaAc，-20℃沉淀1h，12000r／min離心15min，75％乙醇500μl洗，再12000r／min離心10min，最后加入TE—buffer30—50μl，待瓊脂糖電泳檢測。

1.3 AFLP分析

采用北京鼎國生物技術有限責任公司生產的AFLP試劑盒(EcoRI／MseI型)，其中選擇性擴增引物MseI為FAM熒光標記引物，試驗步驟參見該試劑盒的操作指南。

選擇性擴增產物的檢測：取2μl選擇性擴增產物樣品，在377DNA自動測序儀(ABI Prism377 DNA Sequencer，Apllied Biosystems，Foster cjt—y，CA.USA)上，50w和最大3000V條件下，于4％聚丙烯酰胺凝膠上電泳2.4h，自動采集電泳膠圖。

1.4 數據分析

用GENESCAN3.1軟件打開膠圖，安裝膠圖的MATRIX，選擇合適的內標即SIZE STANDARD并設置軟件合適的分析參數進行分析，進而得到結果。通過Binthere軟件提取樣品各片段大小的結果：打開Binthere軟件，設置片段大小的范圍，導人數據，選擇相應的熒光標記的顏色并選擇合適的內標即SIZE STANDARD，點擊分析，導出結果并將結果保存為，xls格式。將表內數值不為0的轉換為1(數值為O的不轉換)，從而生成由“1”和“0”組成的原始矩陣。

用POPGENE Version 1.32軟件對26個山東省主要栽培杏品種及其后代進行遺傳多樣性分析。利用NTSYSpc-2.1lF軟件，采用Lei＆Li相似系數，根據UPGMA方法對山東主栽杏品種進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 山東杏遺傳多樣性的AFLP分析

從64對EcoR I／MseI引物中篩選出8對擴增產物多態性好、譜帶清晰的引物，利用其對表1中的26個山東杏主栽品種及雜交后代的基因組DNA進行AFLP分析，引物E—AAC／M—cTr的電泳圖譜見圖l。由表2可以看出，8對引物共擴增出945條帶，其中多態性位點數為826，平均擴增出103.25條多態性帶，多態性百分比為87.37％。不同的引物組合擴增的多態性位點數目和多態位點百分比明顯不同，8對引物組合擴增的多態性位點數從58(E—AAG／M—CAG)到142(E—AAC／M—CTT)條不等；E—AAG／M—CTG引物組合的多態性百分比最高為94.25％，E—AAG／M—CAG引物組合的多態性百分比最低為79.45％。不同引物檢測的總位點數從73(E—AAG／M—CAG)到156.99(E—AAC／M—CTT)條不等，平均總位點數為117.746。對各位點的Nei’s、基因多樣度(H)和香農信息指數(I)的統計結果顯示，各位點的H值為0.1596—0.2413，平均為0.1935，I值為0.2633—0.3736，平均為0.3100。

2.2 山東杏聚類分析

對26個山東主栽杏品種及其雜交后代進行聚類分析，結果(圖2)表明，在相似系數為58.58％處展開，所有品種可以分為四大類，第1類由山東本地品種關爺臉、巴旦水杏，雜交后代早荷、水杏實生苗大果，以及美國引進品種金太陽、凱特實生后代實生1號6個品種組成；第Ⅱ類由17個品種組成，內部又可分為3個亞類，第一亞類主要由4個山東本地品種嶗山紅、作石杏、圓果紅杏、假麥黃和2個美國引進品種凱特、Moorpark以及凱特后代97—7、97—8組成，第二亞類由來自新疆的珍珠油杏、山東本地品種早玉杏和山東本地品種紅荷包及其5個雜交后代組成，第三亞類由山東本地品種少山2號單獨構成；第Ⅲ類由山東本地品種玉巴旦單獨組成；第Ⅳ類由大麥黃和楊繼元兩個山東本地品種組成。

3 結論與討論

3.1 山東主栽杏品種遺傳多樣性分析

苑兆和等采用熒光AFLP技術對華北生態群和歐洲生態群9個栽培杏的遺傳多樣性進行分析，華北生態群平均擴增出85.71條多態性帶，多態性位點百分比為39.68％，Nei’s基因多樣度為0.116，香農信息指數為0.180。歐洲生態群多態性位點數為85.14，多態性位點百分比為39.42％，Nei’s基因多樣度為0.124，香農信息指數為0.189，可見，這兩個群體杏品種的遺傳多樣性豐富。本試驗采用熒光AFLP技術對山東杏主要栽培品種的遺傳多樣性分析表明，26個杏品種平均擴增出103.25條多態性帶，多態性百分比為87.37％，Nei’s基因多樣度為0.1935，香農信息指數為0.3100，多態性指標均高于華北生態群和歐洲生態群，說明山東主栽杏品種遺傳多樣性更為豐富。

3.2 山東主栽杏品種的育種展望

對山東主栽杏品種及其雜交后代的聚類分析結果顯示，山東本地品種紅荷包及其5個雜交后代都聚在同一亞類，說明AFLP的可靠性；但同時，美國的3個品種及其3個后代并沒有聚在一類，這同沈向等的研究結果一致，說明美國杏品種內部遺傳上也存在較大的變異。金太陽同山東杏遺傳關系較近，說明中國作為杏的起源中心，美洲杏也滲入了部分亞洲杏的種質。玉巴旦、大麥黃和楊繼元3品種為山東省青島市主栽品種，分別聚在第三類和第四類，和其它山東本地品種以及歐洲品種遺傳距離較遠，這可能與3個品種自身特性有關，具體機理還有待于進一步研究。

山東省本地杏種質屬于華北生態群，但是華北生態群的杏品種多數自交不親和，晚霜又影響花期傳粉昆蟲的活動，造成傳粉受精不良而嚴重影響當年的產量。從美國引進的杏品種屬于歐洲生態群，這一生態群的最大特點是大多品種表現自交親和。玉巴旦和楊繼元為山東省百年前的古老品種，風味佳，完全適應山東地區的氣候，凱特等美國杏由于自花結實，豐產性強，在山東省大量種植，但風味較淡。因此，結合二者的優良性狀，對于培育適合山東地區種植的杏優良品種具有廣闊的前景。