抗凍蛋白及其在食品領域中的應用

摘要：抗凍蛋白是具有熱滯活性，能改變冰晶的形態和抑制冰重結晶的一類蛋白質。本文介紹了各種抗凍蛋白的結構、功能、活性及作用機制，并對其在冷凍食品領域中的應用進行了系統的綜述。

關鍵詞：抗凍蛋白；食品；應用

中圖分類號：Q511；TS972.24 文獻標識號：A

文章編號：1001—4942(2010)11—0089—04

抗凍蛋白(Antifreeze Proteins，AFPs)是一類能抑制冰晶生長的特殊蛋白質，它能夠非依數性地降低水溶液的冰點，但對熔點的影響甚微，從而導致水溶液的熔點和冰點之間出現差值，這種差值稱為熱滯活性(Thermal Hysteresis Activity，THA)，因而AFPs亦稱為熱滯蛋白(Thermal Hys—teresis Prioteins，THPs)，具有三個基本特征：熱滯效應、冰晶形態效應、重結晶抑制(Recrystalliza-tion Inhibition，RI)效應。 1969年，DeVeries在南極海峽的一種魚(Nototheneniid)的血液中首先發現了具有這種性質的蛋白。其后幾十年里研究對象遍及極區魚類、昆蟲到植物材料及細菌、真菌等。魚類抗凍蛋白的研究較為深入；昆蟲抗凍蛋白的研究也可追溯到20世紀60年代；而植物抗凍蛋白的發現較晚。抗凍蛋白通過吸附到冰晶表面，由于開爾文效應使冰晶的生長處于熱力學上不利的狀態，從而抑制冰晶的生長，保護避免結冰或者對結冰敏感的生命有機體免受結冰引起的傷害。由于抗凍蛋白具有阻止冰晶生長而不破壞細胞的特點，因而，有望在食品原料的冷處理、冷凍食品的保鮮等方面發揮重大作用。

1 抗凍蛋白的分類及結構分析

按抗凍蛋白的來源分，主要有魚類抗凍蛋白、植物抗凍蛋白、昆蟲抗凍蛋白以及其他來源的抗凍蛋白。

1.1 魚類抗凍蛋白

迄今為止在魚類中共發現了5種抗凍蛋白，分別是抗凍糖蛋白(AFGPs)、I型抗凍蛋白(AFPI)、Ⅱ型抗凍蛋白(AFPⅡ)、Ⅲ型抗凍蛋白(AFPⅢ)和Ⅳ型抗凍蛋白(AFPⅣ)。AFGPs于1969年首先由DeVeries在魚(Trematomus boro—hgrevinki)的血液中發現，肽鏈是由Ala—Ala—Thr三肽單位重復組成，分子量從2.7-32ku，活性隨分子量的增加及重復數的增多而提高。AFP I由Duman和DeVries于1974年在北大西洋沿海的美洲擬鰈(Pseudopleuronectes americanus)(俗稱冬鰈)的血清中發現，分子量為3.3—4.5ku，其二級結構全為α－螺旋。AFPⅡ僅發現于少數幾種魚類(如海渡鴉、胡爪魚和鯡魚等)的血清中，其重要特征在于富含半胱氨酸(海渡鴉中8.3％、大西洋鯡中9.3％)。在大洋條鱈(Macrozoacreesamericnus)中發現的AFPⅢ既不富含丙氨酸，也沒有半胱氨酸，分子量約6ku。用NMR和x一射線衍射技術分析表明：其二級結構主要由9個β一折疊組成，其中8個β－折疊組成三明治夾心結構，另一個β－折疊則游離在其外。AFPⅣ是從長角杜文魚(Longhomsculpin，Myoxocephalusoctodecimspinosis)血清中分離到的一種新型抗凍蛋白(LS-12)，該抗凍蛋白含有108個氨基酸，分子量約為12.3 ku，并且含有高達17％的Glu。

1.2 昆蟲抗凍蛋白

1964年，Ramsay在研究黃粉甲(Tenebriomolitor)幼蟲時，發現體液的冰點明顯低于熔點；1968年，Gfimstone等證明黃粉甲幼蟲能夠產生抗凍蛋白。隨后，科學家們在多種昆蟲體內發現了抗凍蛋白的存在。2004年，Duman等分別檢測了生活在美國阿拉斯加州的75種昆蟲和6種蜘蛛的血淋巴，結果在18種昆蟲和3種蜘蛛的血淋巴中檢測到抗凍蛋白的存在；Kristiansen等在Longhorn beetle(Rhagium inquisitor)血淋巴中發現6種抗凍蛋白，這一結果說明抗凍蛋白在昆蟲中是比較普遍存在的。Gramham等發現黃粉甲的AFP活性是魚類的100倍。自此昆蟲抗凍蛋白的研究引起世界各國專家的普遍關注。

目前，昆蟲抗凍蛋白的研究對象以黃粉甲(Tenebrio molitor)、云杉卷葉蛾(Choristoneura fu-miferana)和赤翅甲(Dendroides canadensis)三種昆蟲為代表，它們體內都包含多種結構相似、長度相同或不相同的抗凍蛋白同系物。

黃粉甲抗凍蛋白是具有右手平行β-螺旋結構的小分子蛋白，通過多個二硫鍵交連，螺旋結構內包含串聯重復的由12個氨基酸殘基(TCTX-SXXCXXAX)組成的環。云杉卷葉蛾抗凍蛋白(cfAFP)具有左手β-螺旋結構，每環由15個氨基酸殘基組成。赤翅甲抗凍蛋白(DcAFP)也具有右手β-螺旋結構，氨基酸序列包含由12或13個氨基酸殘基組成的重復序列：Cys—Thr—X3—Ser—X5—Cys—X8—X9—Ala—X1l—Thr—X13，在成熟蛋白質中每隔6個氨基酸有一個半胱氨酸，這與黃粉甲抗凍蛋白類似。

1.3 植物抗凍蛋白

到目前為止被研究的植物材料多達40余種，現已陸續在冬小麥、燕麥、冬黑麥、黑麥草、歐白英、胡蘿卜、沙冬青、桃樹、唐古特紅景天、甜楊等至少26種高等植物中獲得具有熱滯活性的AFP，其中，有6種代表性植物即冬黑麥、歐白英、沙冬青、桃樹、胡蘿卜及冬麥草的AFPs已被提純。這些AFPs在分子量、氨基酸組成及同源性上都不盡相同。它們的熱滯值(通常為0.2－0.5℃)較極區魚(通常為0.7—1.5℃)、昆蟲(通常為3－6℃)低。

2000年7月，英國York大學的科學家們在低溫誘導的黑麥草(Lolium perenne)中發現具有熱穩定性AFP，這種蛋白由118個氨基酸組成，分子量為11.77ku，其熱滯值(0.1－0.45℃)遠遠低于魚類和昆蟲，但對冰晶重晶化的抑制效應是大洋條鱈的抗凍蛋白(TypeⅢ)的200倍，在100℃時仍穩定存在。

Huang等從冬季歐白英中克隆得到一種熱滯蛋白基因sthp-64，并得到了全長的熱滯蛋白STHP-64。該蛋白與WRKY蛋白極為相似，WRKY蛋白在植物中是調節病原菌相關蛋白(Pathogen Related Protein)翻譯的重要因子，由此推測AFPs和抗病蛋白存在著某種聯系，可能具有抗凍和抗病雙重功能，而且這些低溫誘導的病原相關蛋白可能起著改變植物體液的結冰特性或冰晶結合位點的作用。

2001年，在冰緣植株珠芽蓼(Polygonumviviparum)葉片中提取的蛋白中發現AFPs，分子量為15.2-72.3ku，均為AFGP。熱滯值可達0.3℃(7.8mg/m1)，是迄今為止在動植物中得到的分子量最大的AFP。

2002年，Nelly等從Boreogadussaida中分離純化得到一種N端被甲基化的AFGP。通過13C核磁共振和傅立葉變換紅外光譜儀對其動力學構象進行研究表明：AFGP無論在什么條件下基本上都保持著一種相似的三維折疊結構。該AFGP的水化作用和相對穩定的主鏈構象在抑制冰晶生長中發揮著重要作用。

2005年，Bravo等發現：南極海區的植物Deschampsia antarctica經過冷誘導后，AFPs的量增加，活性增強，而且有很寬的pH值范圍，SDS—PAGE顯示有13個多肽。

最近，Zhou等利用魚類的抗凍蛋白(TypeⅢ)作為抗體，與經過冷誘導的常青地被植物Ter-minalis Sieb，＆Zucc中產生的蛋白進行反應，結果免疫反應發生，這是關于魚類抗凍蛋白和植物蛋白具有免疫反應的第一次報道。

2 抗凍蛋白的活性

抗凍蛋白具有兩種效應，一種效應稱為熱滯效應，抗凍蛋白能夠非依數地降低溶液或者體液的冰點，但是不改變熔點，二者之差稱為熱滯值；另一種效應是重結晶抑制效應。重結晶指已經形成的冰晶顆粒之間進行生長重分配，有的增大，有的減小，或者小冰晶聚合成大的冰晶。重結晶抑制效應是指抗凍蛋白對重結晶的抑制，避免形成體積過大的冰晶而對組織造成機械損傷。抗凍蛋白的活性一般指它的熱滯活性，用熱滯值表示。

3 抗凍蛋白的功能

抗凍蛋白的主要功能是保護生命有機體安全順利度過低溫脅迫的生存環境，通過吸附抑制機制，限制冰晶生長，從而保護生命有機體免受結冰引起的傷害。抗凍蛋白只影響結冰過程，幾乎不影響熔化。抗凍蛋白的功能除了能產生熱滯效應外，還能改變冰晶的形態，能夠結合并抑制冰晶生長，降低血漿的冰點；它還能顯著抑制冰晶生長速率，極低濃度就能抑制重結晶，防止小的冰晶凝聚成大的冰晶；另外，AFP能阻斷Ca²⁺、K⁺通道，維持細胞膜的穩定性，抑制冰晶對細胞膜的損傷；AFP還可能與昆蟲體內水分平衡有關，可增強細胞或體液的保水能力。

4 抗凍蛋白的作用機制

在動植物中發現的AFPs結構各異，沒有共同的演化規律，因此認為不同的AFPs的抗凍機理也不盡相同。有關魚類抗凍蛋白抗凍機制的研究已有較多的報道，曾提出多種假說，如結合水學說、空間屏障及吸附抑制機制等。目前對昆蟲抗凍蛋白的作用機制還不十分明確，一般認為它們不是作為溶質使昆蟲血淋巴的滲透壓增加而使冰點下降，而是吸附于冰晶表面阻止冰晶的進一步增長，從而降低血淋巴的冰點，即所謂的吸附抑制理論。吸附抑制理論認為抗凍蛋白吸附在冰晶表面，通過Kenlin效應抑制其生長。機制的模型為：一般晶體的生長垂直于晶體的表面，假如雜質分子吸附于冰生長通途的表面，那么需要再外加一推動力(冰點下降)，促使冰在雜質間生長。由于曲率增大，邊緣的表面積也增加。因表面張力的影響，增加表面積將使體系的平衡狀態發生改變，從而冰點降低。

5 抗凍蛋白的基因工程

Holmberg等把編碼煙草致病相關蛋白先導序列的基因和編碼成熟云杉卷葉蛾抗凍蛋白的主要序列融合，把合成基因導人煙草基因組。轉基因成功的煙草表現出較強抗凍能力。

尹明安等以寧夏吳忠胡蘿卜、陜西華縣胡蘿卜和陜西漢中胡蘿卜3個地方品種為材料，克隆了中國胡蘿卜的抗凍蛋白基因。2001年，尹明安等又以PCR法在體外擴增出胡蘿卜抗凍蛋白基因，并構建成胡蘿卜AFP的植物表達載體pBAF，為進一步利用其轉化番茄、甜椒等作物奠定了實驗基礎。

2004年，Marshall等通過基因工程方法，在由84個氨基酸組成的黃粉甲抗凍蛋白基因序列的基礎上減去或者加上螺旋環，分別構建了包含6－11個螺旋環的重組基因，表達產物通過親和層析剔除了錯誤折疊的蛋白質。結果表明9個螺旋環的蛋白活性最強。但當螺旋環增加到10-11時，活性開始下降。這與Liu等最近的研究結果一致，即在一定范圍內，隨著串聯重復的螺旋環數量的增加，抗凍蛋白的β-螺旋與冰晶之問的匹配程度逐漸降低，螺旋環數量達到一定數量時，相互作用能量達到上限。

2005年，國內劉忠淵等在大腸桿菌中以融合蛋白形式表達赤翅甲抗凍蛋白獲得成功，活性檢測結果表明，抗凍融合蛋白也能在一定程度上提高細菌的耐寒能力。另外，趙干等成功克隆并在原核生物體內表達出了準噶爾小胸鱉甲融合抗凍蛋白，細菌的抗凍實驗結果顯示該蛋白對細菌具有顯著的抗凍保護作用，保護效果與抗凍蛋白劑量呈正相關。

2009年，黃粉甲抗凍蛋白基因afp84α在大腸桿菌中獲得高效表達，0℃和-1.5℃活性實驗表明，重組蛋白具有較高的抗凍效應(本文作者研究成果，待發表)。

6 抗凍蛋白在食品領域中的應用

抗凍蛋白的特性在20世紀60年代末報道后，美、加、英等國很多學者紛紛將其抗凍性應用到食品中去。特別是基因工程的發展為抗凍蛋白在食品領域中的應用提供了更好的條件。

6.1 食品運輸和貯藏方面的應用

抗凍蛋白可抑制冷凍貯藏過程中冰晶的重結晶，果蔬貯藏時的溫度越低，品質保持的越好，大部分果蔬可以在－18℃實現跨季節凍藏。但果蔬質膜均由彈性較差的細胞壁包裹，凍結過程對細胞的機械損傷和溶質損傷較為突出，因此適宜低溫點的選擇往往取決于貯藏對象的耐低溫能力，由于果蔬品種、組織成分、成熟度等多種因素不同，對低溫凍結的承受能力差別很大。食品在解凍過程中常出現的問題是汁液流失、軟爛、失去原有的形態。造成汁液流失的原因與食品的原料、凍結方式、凍藏條件以及解凍方式有關。能表達抗凍蛋白的轉基因蔬菜可改善這種狀況，提高速凍品的質量。這是因為轉基因蔬菜在凍結與凍藏中冰晶對細胞和蛋白質的破壞很小，合理解凍后，部分融化的冰晶也會緩慢滲透到細胞內，在蛋白質顆粒周圍重新形成水化層，使汁液流失減少，保持了解凍食品的營養成分和原有風味。

6.2 在冷凍乳制品中的應用

目前，抗凍蛋白在食品中最成功的應用是添加到冷凍乳制品中，抑制冰的重結晶現象，提高冷凍食品的質量。組織細膩是冰淇淋感官評價的一個重要標準，它主要取決于冰淇淋中冰晶的尺寸、形狀及分布。冰晶越小、分布越均勻、越柔軟細膩，口感越好。所以在冰淇淋的加工和貯藏過程中，必須控制冰晶的尺寸。冰淇淋在貯存、運輸過程易受升溫或溫度波動的影響，溫度波動對冰晶的影響更大，因為當溫度升高時，冰淇淋中的未凍水分增多，而溫度降低時，未凍水分重新凝結，使原來細小的冰晶長大。可見，在貯存、運輸過程中冰晶的再結晶使冰淇淋的質地粗糙，失去了原有的細膩口感。

6.3 在肉類食品冷藏中的應用

研究發現將肉浸泡在抗凍蛋白溶液中凍藏后可以明顯減小冰晶的大小。抗凍蛋白以一定的方式與肉組織結合，但在肉中的擴散需要一定的時間，在羊屠殺之前，把抗凍糖蛋白注入，結果汁液的流失和冰晶的大小均被抑制了。