小麥成熟胚組織培養體系優化及優良轉化受體基因型的篩選

摘要：為建立適于優良品種遺傳轉化的高效組織培養體系，本研究以3種山東省推廣小麥品種(濟麥19、良星99、魯麥14)和模式品種Bobwhite為材料，以成熟胚為外植體對其愈傷組織進行誘導和分化，探討了2，4-D不同濃度下的3種誘導培養基(Ms、N₆、MSB₅)和4種激素配比的分化培養基對小麥成熟胚離體培養的影響。結果表明，N₆培養基的誘導效果最好，平均誘導率超過了80％，且當2，4-D的濃度為4mg／L時誘導效果最佳。4種激素配比均可誘導小麥成熟胚愈傷組織分化，但分化率較低且處理之間差別較大，添加0.5mg/LIAA和2mg／L ZT的Ms培養基的平均分化率最高，為22.58％。小麥基因型的差別主要影響其分化率的高低而對誘導率的影響不大，3個品種中用于轉化的最佳品種為魯麥14。

關鍵詞：小麥成熟胚；愈傷組織；誘導；分化

中圖分類號：S512.1⁺10.353

文獻標識號：A

文章編號：1001—4942(2010)11—O001—05

小麥是世界上最主要的糧食作物之一，在谷物栽培中居首位，其中普通小麥種植最廣，約占全世界小麥總面積的90％。隨著對小麥抗性、品質研究的深入以及常規育種的限制，應用生物技術對小麥進行品種改良越來越受人們重視，因此，必須建立起高效穩定的組織培養體系為小麥遺傳轉化奠定基礎。

目前，以小麥幼胚、動穗、葉片、根、成熟胚等為外植體進行的遺傳轉化，都成功獲得了再生植株。其中幼胚是轉化成功最多的外植體，許多研究認為幼胚的愈傷組織誘導率和植株再生率都較高，但幼胚易受季節、時間限制，短時間內難以重復試驗，而小麥的成熟胚則能克服幼胚的不足，具有取材方便、周期短、不受季節和植株發育階段限制等優點，因此用作轉化受體最為方便實用，但成熟胚再生率非常低。鑒于此，本試驗以山東省廣泛栽培的3個小麥品種為材料，對其成熟胚進行愈傷組織誘導和分化的研究，旨在探索不同主推小麥品種成熟胚誘導和分化的有效體系以及優良的轉基因受體基因型，為利用轉基因技術改良小麥提供依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

山東省3個小麥推廣品種濟麥19、良星99、魯麥14和模式品種Bobwhite的成熟種子，均由山東農業大學小麥品質育種研究室提供。

1.2 培養基

誘導培養基：

愈傷組織誘導培養基有3種，分別添加2、4、6mg/L 2，4－D，構成9種培養基：

①MS基本培養基+500mg/L水解酪蛋白+不同濃度2，4-D(2、4、6mg／L)，分別稱為MS2、MS₄、MS₆培養基；

②N₆基本培養基+500mg／L水解酪蛋白+不同濃度2，4-D(2、4、6mg/L)，分別稱為N6₆₂、N₆₄、N₆₆培養基；

④MSB₅基本培養基+500mg／L水解酪蛋白+不同濃度2，4-D(2、4、6mg／L)，分別稱為MSB₅₂、MSB₅₄、MSB₅₆。

分化培養基：

以MS培養基為基本培養基，因所加的激素配比不同構成4種分化培養基，如下：

①MS基本培養基+0.5mg/LIAA+1mg/L ZT

②MS基本培養基+O，5 mg／L IAA+2 m∥L ZT

③MS基本培養基+1mg/LIAA+lmg/LzT

④MS基本培養基+1mg／LIAA+2mg/LzT

以上所有培養基均添加30g／L蔗糖和8g／L瓊脂粉，用NaOH調pH值到5.6—5.8，在121℃下經1.1kg/cm²高壓濕熱滅菌20min。

1.3 方法

1.3.1 種子預處理

取顏色、大小一致的小麥種子各約500粒，用無菌ddH20沖洗一次，70％酒精處理1min，然后無菌水沖洗一次，再用無菌水浸泡，封口過夜浸泡18h，次日對種子進行消毒處理，在超凈臺上用1‰的升汞消毒10min，無菌水漂洗3—4次。

1.3.2 成熟胚培養

剝取成熟胚，切碎，盾片向上置于誘導培養基上(9cm培養皿平均每11／1.40—50個)，重復3次，在培養皿上標明品種、培養基、日期和胚數，25℃暗培養兩周，統計出愈率。挑選生長良好的胚性愈傷組織轉入分化培養基進行光照培養，光強2000lx，每天光照16h，培養溫度為(25±1)℃，每兩周繼代培養一次，30d后統計愈傷組織分化率(隨時觀察，及時剔除褐化和污染愈傷)。

1.3.3 數據處理與分析

出愈率(％)=(出愈外植體數／接種外植體數)×100，棄去污染和褐化的愈傷組織不計；分化率(％)=(分化出芽的愈傷數／接種愈傷數)×100，棄去污染和褐化的愈傷組織不計；

采用DPS統計分析軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同誘導培養基及2，4－D濃度對小麥成熟胚愈傷組織誘導率的影響

2.1.1 不同誘導培養基對小麥成熟胚愈傷組織誘導率的影響小麥成熟胚在接種2—3d后即可誘導產生愈傷組織，14d后統計各培養基的愈傷組織誘導率(表1)，結果表明，小麥成熟胚在各個培養基上均可誘導產生愈傷組織，但誘導效率和愈傷質量各不相同?？傮w來說，N₆培養基的誘導效率較高，其平均出愈率為81.40％；MS和MSB₅培養基的平均誘導率均低于80％，分別為72.40％和74.44％，但三者之間差異不顯著。MS培養基上除濟麥19的出愈率較低(42.22％)外，其它3個品種的出愈率均在80％以上；MSB₅培養基上除了良星99的出愈率較低(54.85％)外，其它3個品種的出愈率均在70％以上。從愈傷組織的質量來看，N₆培養基的大多數愈傷組織結構較致密，呈淡黃色，明顯好于MS和MSB₅培養基上的愈傷組織。因此，N₆培養基誘導愈傷的效果較好。

2.2 不同激素配比對小麥成熟胚分化率的影響

2.1.2 2.4－D不同濃度對小麥成熟胚出愈率的影響不同濃度2，4－D對愈傷組織出愈率的影響因培養基和品種不同而異(表1)，隨著2，4－D濃度的升高，愈傷組織的出愈率變化沒有規律可循，因此，不同的品種在不同的培養基上適宜的2，4－D濃度不同，其中，MS在2mg/L 2，4-D濃度下誘導率最高，N₆和MSBs分別在4、6mg／L濃度下最高。從愈傷的質量來看，大多數含4mg／L2，4-D的培養基誘導的愈傷質量要好于含2mg/L和6mg／L 2，4-D的培養基。就本試驗的4個品種而言，N₆₄培養基的誘導率最高，均在90％左右。

誘導培養14d后，挑選生長良好的胚性愈傷組織轉移到不同激素配比的分化培養基上繼續培養，除少數愈傷組織停止生長逐漸褐化外，大部分愈傷大約3—5d就開始分化，先長出綠點繼而分化出苗。30d后統計各培養基的分化率，其結果見表2。不同激素配比均可誘導小麥成熟胚愈傷組織的分化，但不同處理的分化率差別很大，最低的為4.76％，最高的為42.22％。就分化率的平均值而言，表現為隨著ZT濃度的升高，：分化率也有所提高，4個供試品種也大體表現出相同的趨勢。

2.3 不同基因型對小麥成熟胚離體培養的影響

從表3可知，不同基因型之間愈傷組織的出愈率差異不顯著；Bobwhite的分化率顯著高于濟麥19，但與其

它兩品種的差異不顯著。綜合愈傷質量和平均出愈率來看，由高到低依次為魯麥14、Bobwhite、良星99、濟麥19，愈傷培養結果以MS2培養基為例見圖1。4個品種的分化率普遍偏低，其中Bobwhite最高(28.06％)，濟麥19最低(10.23％)。

3 討論與結論

小麥胚性愈傷組織出愈率和分化率的高低，除受小麥基因型影響外，還與培養基成分、外源激素的種類和濃度等因素有關。本研究所用的3種愈傷誘導培養基的大部分元素都相同，只是有機成份和2，4－D濃度差別較大，誘導愈傷組織出愈率最高的是N₆₄培養基，平均誘導率超過了90％，且N₆₄培養基誘導的愈傷組織結構致密，呈淡黃色，質量也較好，因此從總體上來說N₆₄培養基對于這4種品種的出愈率而言是較好的。

在植物組織培養中，生長素和細胞分裂素的相對濃度控制著根和芽的分化，在小麥組織培養中多用較低濃度的IAA或NAA附加不同濃度KT或zT來誘導愈傷分化。與前人結果相比，本試驗中4種激素配比對供試品種成熟胚愈傷組織的分化率偏低，平均分化率最高僅為22.58％，為添加0.5mg／LIAA和2mg／LZT的培養基，其中Bobwhite的分化率最高，為42.22％?？赡苡袃煞矫娴脑颍皇怯捎谒x小麥品種基因型的限制，二是因為成熟胚直接萌發出的芽較多(非胚性愈傷較多)。

小麥成熟胚的誘導和分化與其基因型有密切關系。從本試驗結果來看，各品種的出愈率相差不大，但分化率差異較大，因此基因型主要影響其分化率，這與邢莉萍等的研究結果一致。除Bobwhite外，其它3個基因型中，用于轉化的最佳品種是魯麥14，其次是良星99、濟麥19。

由前人的報道和本試驗結果來看，成熟胚的愈傷組織誘導并不困難，但其胚性愈傷組織較少，非胚性愈傷較多，而且誘導過程中胚容易直接萌發出芽，從而影響分化率，所以在試驗中應及時切去萌發的小芽，否則會影響愈傷的繼續生長，劉香利等發現在接種時用鑷子夾傷胚芽可獲得較理想的效果。