一株發酵床接種用枯草芽孢桿菌的分離鑒定

摘要：從發酵床養殖墊料堆體中分離篩選到一株細菌，再次接種鋸末、稻殼與鴨糞的混合物，與空白對照組相比，堆積時間縮短3天，單位發酵墊料對糞污的處理能力增加，墊料在使用28—49天間，氨氣排放降低30％—50％。經16SrDNA序列比較，該菌為枯草芽孢桿菌。

關鍵詞：發酵床；枯草芽孢桿菌；接種劑

中圖分類號：Q939.11⁺8

文獻標識號：A

文章編號：1001—4942(2010)11—0071—04

發酵床養殖技術起源于日本和巴西的自然養豬法，主要是將鋸末、稻殼等材料接種生物菌種后堆積發酵后用做墊料，使糞污分解產生的臭味物質轉化為菌體固定下來，達到降低養殖舍內有害氣體濃度、減少養殖污染排放的目的。

選擇合適的菌種是發酵床是否能夠成功應用的基礎與前提，只有使發酵床墊料中具有生理特性的菌種達到一定數量，才能保證發酵墊料的使用效果。糞便與發酵床的周邊環境中同樣存在多種微生物，必須向發酵床中接種合適的菌種才能達到減少污染排放的目的。其中，最值得關注的是兩個方面：第一，接種的微生物必須具備旺盛的蛋白質代謝能力。謝金防等(2008)指出動物糞便中各種營養成分十分豐富，放置在自然環境中時，會因微生物快速生長代謝而放出大量惡臭氣體，因此提出需要篩選的菌株必須具備較高的蛋白酶產生活力，以促進有機物降解，加速糞污腐熟進程，同時還有利于消除致臭物質，減輕對環境的污染。第二，接種的微生物必須適應發酵床的生理生化環境。發酵床溫度在40—50％，堆積時最高超過70℃，在此條件下大量微生物營養細胞死亡，只有耐受高溫的微生物能夠生存或者轉化為休眠的孢子等待合適的溫度萌發。因此，進行發酵床接種菌的篩選時，必須考慮該菌對高溫環境的耐受性。筆者從發酵墊料的堆積物中篩選具有高效糞污降解能力的優勢菌株，有望獲得適應現有發酵床使用環境的接種劑。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮鴨糞由山東省農業科學院家禽研究所鴨舍現場采集，鴨糞含水量80％左右，干燥后粗蛋白含量20％—24％。稻殼、鋸末購自濟南周邊農村。大腸桿菌DH5a為山東省農業科學院家禽研究所禽病診斷與免疫重點實驗室保存。細菌染色體提取試劑盒購自TaKaRa公司，UNIQ—10柱式DNA凝膠回收試劑盒購自上海生工，其它試劑均為分析純。

1.2 游離氨氣測定方法

墊料中鋸末與稻殼的比例為1：1，加入發酵菌劑后，調節含水量在50％—60％，添加墊料干重30％的鴨糞后攪拌均勻，堆積厚度為80cm，室溫20—30℃?？刂频傍嗭曫B密度，每天向墊料中排放墊料干重10％的鴨糞，每天均勻翻動一次，每周測定墊料附近空氣的氨氣含量。

墊料剖面挖成后，縱向每隔10cm取墊料樣品，每層采用氨氣比色管法測5點。即將墊料取樣后，立即置于500ml燒杯中，密封放置1h，以氨氣測定管測定燒杯內空氣中氨氣含量。

1.3 優勢菌的篩選及計數

取發酵墊料1g，在超凈工作臺中，加10ml雙蒸水浸泡10min，無菌紗布過濾除渣，后將浸泡液采用10倍比遞增稀釋至10^-8，將10^-1……10^-8的不同稀釋度取100μl，分別在LB培養基上均勻涂板，每個稀釋度重復3次，37℃恒溫培養36h后，進行細菌計數。

1.4 優勢菌16SrDNA的提取與序列測定方法

細菌16SrDNA通用引物，由濟南博尚生物有限公司合成(P1：5′－AGAGTYTGATCCTGGCT－CAG－3′；P2：5′－GGTTACCrTGTrACGACTT－3′)。發酵床優勢菌以LB液體培養基擴大培養，采用細菌染色體提取試劑盒提取染色體DNA，以其為模板，以P1、P2為引物進行PCR擴增。PCR擴增條件：94℃預變性2min；然后94℃變性1min，48℃退火50s，72℃延伸2min，共30個循環，最后于72℃延伸10min。以UNIQ-10柱式DNA凝膠回收試劑盒對PCR產物電泳條帶進行回收和純化?；厥债a物與PMD18-T載體體外連接，之后轉化感受態細胞大腸桿菌DH5α，將陽性菌送上海博亞生物技術有限公司測序。

2 結果

2.1 優勢菌的篩選

堆積過程中，從墊料表面到50cm處溫度隨墊料深度而升高，而整個墊料主體發酵溫度在28—70℃之間。長時間堆積發酵能充分殺滅墊料中的有害微生物。堆積完成后，未檢測到沙門氏菌，大腸桿菌檢測濃度為100個／g，主要檢測到一種菌，通過對該發酵墊料進行梯度稀釋，檢測到該種菌的濃度為10⁵個／g土。

2.2 優勢菌的生長特點

在平板上的菌落形態為表面不規則、邊緣不整齊的白色菌落。取單菌落接種到LB培養基中，37℃震蕩培養10h，后取50μl接種在4mlLB培養基中，在不同溫度下震蕩培養6h，測OD₆₀₀值。在堆積發酵的過程

中，該菌在較高溫度下，具有良好的生長與存活能力。在20—44℃之間，發酵物中大腸桿菌的量高于優勢菌，而在44—54℃之間，發酵物中優勢菌的量高于大腸桿菌(圖2)。而在75—80℃下保溫12h，該菌的孢子仍能夠萌發，因此，適應堆積發酵的高溫環境。

2.3 優勢菌的鑒定

經PCR可測得優勢菌16SrDNA的大小為1500bp(圖3)，與目的片段大小一致。

測序結果如圖4所示，與GenBank中編號為gb FJ876834.1的枯草芽孢桿菌EBS05菌株的核糖體RNA序列相似性在99％以上，因此判斷本研究分離得到的發酵床優勢菌株為枯草芽孢桿菌。

2.4 枯草芽孢桿菌作為發酵劑的應用效果

采用分離到的枯草芽孢桿菌作為發酵劑與無接種劑的對照組相比，堆積發酵過程中，堆體升溫速度顯著提高，升溫至50℃所需時間縮短3天左右；以該方法堆積獲得的墊料在28—49天時，氨氣的排放量降低30％—50％(圖5)。

3 結論與討論

好的發酵菌劑能夠耐受堆積發酵的高溫環境，并且獲得生長優勢。在發酵墊料的使用過程中，具有較高的生長速度和蛋白降解能力，能夠有效縮短堆積時間，提高發酵墊料的使用效果。

菌體的篩選通常在需要降解的目的產物附近環境中進行，如何宏勝等(2006)從滇池的淤泥中分離微囊藻毒素的降解菌，鄭惠華等(2009)從牛糞和麥秸堆肥中篩選纖維素酶高產菌株。尹紅梅等(2010)認為產蛋白酶活力較高

的菌株適宜作為發酵菌劑補充至墊料中。本試驗分離到的枯草芽孢桿菌即屬于此類菌種。

本試驗從鴨糞發酵堆體中分離篩選到一株鴨糞降解高效枯草芽孢桿菌。其生長溫度比大腸桿菌高6℃左右，且在溫度較高時，該菌的營養細胞轉化為孢子能耐受70—80℃的高溫。以該菌為接種劑可縮短堆積發酵升溫時間3天左右，28－49天間，發酵墊料中氨氣的排放量可降低30％－50％。該菌為適宜發酵床使用環境的接種菌。