犁頭鰍屬魚類物種地理分化過程

唐瓊英，俞 丹，楊金權，劉煥章,*

（1. 中國科學院水生生物研究所 水生生物多樣性與保護重點實驗室，湖北 武漢 430072；2. 上海海洋大學 魚類研究室，上海 201306）

犁頭鰍屬魚類物種地理分化過程

唐瓊英1，俞 丹1，楊金權2，劉煥章1,*

（1. 中國科學院水生生物研究所 水生生物多樣性與保護重點實驗室，湖北 武漢 430072；2. 上海海洋大學 魚類研究室，上海 201306）

犁頭鰍屬為中國的特有屬，包括犁頭鰍和長鰭犁頭鰍兩個物種。犁頭鰍廣泛分布于長江中上游，而長鰭犁頭鰍則局限分布于閩江水系。該研究對采自長江中上游的犁頭鰍20個個體和閩江水系的長鰭犁頭鰍8個個體的線粒體細胞色素b（cytb）基因序列進行分析，以期對犁頭鰍屬魚類的物種地理分化過程進行研究。結果顯示，犁頭鰍不同單倍型之間的遺傳變異水平為0.1%～1.8%，平均為0.7%；長鰭犁頭鰍各單倍型之間的遺傳變異水平為0.6%～1.3%，平均為0.7%；犁頭鰍和長鰭犁頭鰍單倍型之間的遺傳差異也較小，僅為0.2%～1.8%，平均為0.9%。采用鄰接(NJ)法和貝葉斯(BI)法構建的分子系統發育樹都一致顯示，該研究中的犁頭鰍屬魚類構成一個單系；所有長鰭犁頭鰍樣本構成一個單系，位于系統發育樹的頂部位置；犁頭鰍的樣本不構成單系，而是形成并系。從形態上看，犁頭鰍和長鰭犁頭鰍均為有效種。由此推測，在第四紀冰期，長江中下游的犁頭鰍沿東海大陸架向南擴散到東南沿海水系，長鰭犁頭鰍可能是犁頭鰍的一個種群擴散到閩江水系后，由于適應新的環境條件而分化成的一個新物種，剩下的長江流域的犁頭鰍種群則構成一個并系類群。該文對于類似的地理物種形成方式也進行了討論。

犁頭鰍屬；物種地理分化；東海大陸架；長江水系；閩江水系

物種分化是指一個物種產生分化而形成新物種的進化過程。物種分化是物種多樣性形成的基本過程，是生物多樣性起源的重要組成部分。對物種分化的研究是進化生物學最熱門的研究課題之一。2009年是達爾文誕辰200周年和《物種起源》發表150周年紀念，因此，關于物種分化的研究再次成為最活躍最熱門的研究課題。

引起物種分化的因素有很多，其中隔離是一個重要的影響因素。在物種分化過程中，隔離（包括地理隔離和生殖隔離）起著十分關鍵的作用。隔離是物種形成的一個極為重要的條件，隔離導致遺傳物質交流中斷，使群體歧化不斷加深，直至新種形成。隔離（主要是環境隔離）既是物種形成的重要條件，隔離（主要是生殖隔離）同時又是物種形成的重要標志（Xia，2005）。關于物種的分化過程，Avise（2000）認為要經歷復系、并系、單系三個階段，即在進化初期由一個祖先分化出A種群和B種群，它們分別分化出很多分支。隔離的出現使這些分支隨機分布在不同的生境，此時這兩個種群間存在基因交流，相互構成復系關系；在后來的進化過程中，由于自然選擇、瓶頸效應等各種因素的作用，種群B成為一個單系群，而種群A 則可能成為一個并系群。再后來，隨著時間的推移，種群A也會進化為一個單系群。 這樣A和B分別構成各自的單系群，成為兩個分化完全的物種。根據這一假說，一個物種為單系，其祖先種為并系，這一狀態成為物種處于早期分化階段的一個標記。

研究物種分化過程的方法有很多，譜系生物地理學(phylogeography)是近年來隨著分子生物學技術的發展而興起的一門學科，它是采用分子系統發育分析的方法，探討近緣物種或種內族群間的演化與地質歷史事件之間的關系，分析種間或種內支系現有地理分布格局的形成過程（Avise, 2000; Zhang, 2003），進而探討物種的分化機制。近年來，利用線粒體DNA(mtDNA)作為分子標記對動植物進行譜系生物地理學研究已成為熱點，也取得了不少成果，尤其在淡水魚類中。這是因為淡水魚類的分布受水系的嚴格限制，地理隔離廣泛存在。

犁頭鰍屬（Lepturichthys）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鰍超科（Cobitoidea）平鰭鰍科（Balitoridae）平鰭鰍亞科（Balitorinae），是中國的特有屬。Regan（1911）以Homaloptera fimbriataGünther為模式建立了新屬——犁頭鰍屬（Lepturichthys），該屬以具細長的尾柄而顯著區別于Homaloptera屬。后來，Hora (1932)認為采自四川岷江和湖南洞庭湖的犁頭鰍標本不同于采自湖北宜昌的犁頭鰍模式標本，并根據胸鰭不分支鰭條數目、背鰭最長鰭條的長度、全身是否具疣狀刺突、體色體斑等特征分別將采自四川岷江、湖南洞庭湖的標本命名為兩個新種：Lepturichthys guntheri和Lepturichthys nicholsi，但當時描述新種時采用的標本分別僅2尾。陳宜瑜（Chen, 1978）認為L. guntheri和L. nicholsi都應是犁頭鰍L. fimbriata的同物異名。Dai（1985）描述了采自福建南平的一個新種——長鰭犁頭鰍（Lepturichthys dolichopterus）。因此，到目前為止，犁頭鰍屬魚類共包括兩個有效種——犁頭鰍和長鰭犁頭鰍。其中，犁頭鰍廣泛分布于長江中上游，而長鰭犁頭鰍則局限分布于閩江水系（Chen & Tang，2000）。

與大多數鯉科魚類相比，犁頭鰍屬魚類的分布范圍較窄，兩個種呈現間斷分布，為典型的東洋區淡水魚類類群。犁頭鰍屬魚類目前的分布格局是如何形成的；屬內兩個物種的分化過程如何等問題的研究目前還未見報道。

快速進化的線粒體DNA（mtDNA）在進行淡水魚類的譜系生物地理學研究時可以作為一個很好的分子標記。其中細胞色素b（cytb）基因為蛋白質編碼基因，目前已廣泛地運用于各淡水魚類類群的物種分化研究（如：Perdice et al, 2004; Xia et al, 2005; Yang & He, 2008; Zhang et al, 2008; Yang et al, 2009）。本研究擬采用線粒體cytb基因對犁頭鰍屬魚類的物種地理分化過程進行研究，討論其現今分布格局的形成原因，以探討物種分化的規律和機制。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究共包括33個樣本，其中采自長江中上游的犁頭鰍共20個個體，閩江水系的長鰭犁頭鰍共8個個體，并選擇同屬于平鰭鰍亞科的四川華吸鰍(Sinogastromyzon szechuanensis)、下司華吸鰍(S. hsiashiensis)、臺灣間吸鰍(Hemimyzon formosanum)、臺東間吸鰍(H. taitungensis)及廣西華平鰍(Sinohomaloptera kwangsiens)作為外類群進行比較。實驗所用標本均為95%酒精固定樣本，保存于中國科學院水生生物研究所淡水魚類博物館。標本名稱及采集地等詳細信息見表1，犁頭鰍屬魚類的采集地點如圖1所示。

1.2 基因組DNA的提取、PCR擴增及測序

基因組DNA的提取采用高鹽抽提法（Tang et al, 2008）。基因序列片段通過PCR擴增所得。擴增所用引物為L14724和H15915（Xiao et al, 2001）。PCR反應的總體積為60 μL，用大約50 ng的基因組DNA作為模板，反應體系包括：10×Buffer 6 μL，dNTPs0.75 μL（10 mmol/L），引物各1.5 μL（10 μmol/L），TaqDNA聚合酶1.5 U，加滅菌雙蒸水至60 μL。PCR反應條件為：94℃ 預變性3 min；94℃ 變性45 s，52～58℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環；最后在72℃延伸8 min。將獲得的PCR產物送基因公司進行純化回收，采用擴增所用引物對回收產物進行測序。序列遞交GenBank，獲得的序列號見表1。

表 1 研究所用樣本的物種名、編號、個體數、采集地及GenBank序列號等信息Tab. 1 Species, symbols, sample size, sample locations and GenBank accession numbers in the present study

圖 1 本研究中犁頭鰍屬魚類的采集地點Fig. 1 Sample locations for the genus Lepturichthys in the present study

1.3 數據處理及分析

DNA序列的排列使用Clustal X軟件，并在SEAVIEW程序中對序列進行手工調整。單倍型多樣性和核苷酸多樣性的統計采用DNAsp4.9軟件(Rozas et al, 2003）。單倍型之間成對的遺傳距離、各類群內及類群間的平均遺傳差異情況在Mega4軟件（Tamura et al, 2007）中采用Kimura雙參數模型進行計算；序列中各堿基組成、堿基變異情況在PAUP軟件中進行統計分析。序列的核苷酸替代飽和性分析是通過對轉換（transitions, Ts）、顛換（transversions, Tv）的絕對數目和遺傳距離進行作圖分析（替代的絕對數目和遺傳距離均在PAUP軟件中進行統計）。分子系統樹的構建采用鄰接（neighbor joining, NJ）法和貝葉斯法(Bayesian analysis)。鄰接法采用Mega4軟件，各分支的置信度都采用1000次自展分析(Bootstrap analysis)進行重復檢驗。貝葉斯法采用MrBayes 3.0b軟件(Huelsenbeck & Ronquist, 2001)，各分支的置信度以后驗概率（Posterior probability）來表示。

2 結 果

2.1 犁頭鰍屬魚類cyt b基因序列分析

對測序獲得的犁頭鰍屬魚類cytb基因序列進行比對分析后，刪去首尾測序信號較差的堿基，最終用于分析的cytb基因序列長為1 074 bp。20個犁頭鰍個體中共檢測到12個單倍型，單倍型多樣性的平均值為0.937，核苷酸多樣性的平均值為0.00 468；8個長鰭犁頭鰍個體中有4個單倍型，單倍型多樣性的平均值為0.643，核苷酸多樣性的平均值為0.00349。犁頭鰍屬魚類單倍型的分布情況見表2。犁頭鰍樣本中，采自四川樂山與湖北金口的個體存在共享單倍型（LS2和JK2共享單被型Hap1，LS1、LS3、JK8及JK11共享單倍型Hap4），采自湖南桃源的個體與湖北金口的個體存在共享單倍型（TY1和JK14共享單倍型Hap3），湖北金口的個體間也存在共享單倍型（Hap7, Hap9），剩下的7個單倍型為獨有，其中1個為貴州赤水的個體擁有，其它6個為湖北金口的個體擁有。8個長鰭犁頭鰍樣本中，有5個個體共享一個單倍型hap1，其余3個個體擁有獨有的單倍型。

表 2 犁頭鰍屬魚類單倍型的分布情況Tab. 2 The information of haplotypes of the genus Lepturichthys species

對本研究中獲得的所有單倍型及外類群進行序列分析，結果顯示，該基因序列片段中A、C、G、T的平均含量分別為28.0%、29.6%、14.4%和28.0%，A+T的含量（56.0%）明顯高于C+G的含量(44.0%)，同時表現出強烈的低G堿基含量的堿基組成偏向性，尤其在第三位點表現更為明顯，G的含量僅為3.4%。所有序列轉換顛換比(Ts/Tv)的平均值為5.21。在1074個位點中，變異位點有217個，其中簡約信息位點有108個。序列中核苷酸替代的飽和性分析結果表明，轉換和顛換均未達飽和（圖2），因此，所有堿基均可用于系統發育分析。

基于Kimura雙參數模型計算的犁頭鰍屬魚類單倍型之間的遺傳變異情況表明，犁頭鰍不同單倍型之間的遺傳變異水平為0.1%～1.8%，平均為0.7%，長鰭犁頭鰍各單倍型之間的遺傳變異水平為0.6%～1.3%，平均為0.7%，犁頭鰍和長鰭犁頭鰍單倍型之間的遺傳差異也較小，僅為0.2%～1.8%，平均為0.9%，這和犁頭鰍及長鰭犁頭鰍種內單倍型之間的差異類似。犁頭鰍屬魚類和外類群華吸鰍屬、間吸鰍屬及華平鰍間的平均差異較大，分別為5.4%、8.9%和9.5%。

圖 2 Cyt b基因序列中核苷酸替代的飽和性分析圖Fig. 2 Plot of transition and transversion substitutions versus the HKY distance for all positions of the cytochrome b gene sequences

2.2 分子系統發育分析

采用鄰接法和貝葉斯法構建的犁頭鰍屬魚類單倍型之間的系統發育關系如圖3。鄰接(NJ)樹和貝葉斯(BI)樹的拓撲結構大致類似，只在單倍型的分支順序上存在差異。這兩棵系統發育樹都一致顯示，該研究中的犁頭鰍屬魚類構成一個單系，且得到較強的支持（NJ樹中自展值為100，BI樹中的后驗概率為1.00）。分布于閩江水系的長鰭犁頭鰍構成一個單系，位于系統發育樹的頂部位置，但在NJ樹中支持率不高，僅為49，在BI樹中支持率為1.00。所有犁頭鰍的樣本不構成單系，而是形成并系，其中采自湖北金口的兩個個體（JK9和JK1）位于犁頭鰍屬魚類的最基部位置，其它犁頭鰍個體位于系統發育樹的中間位置，犁頭鰍的這種系統發育關系在NJ樹和BI樹中幾乎是一致的。

3 討 論

3.1 犁頭鰍屬魚類的物種有效性

本研究結果顯示，犁頭鰍屬魚類中犁頭鰍和長鰭犁頭鰍這兩個物種間的遺傳差異較小，幾乎和物種內不同個體間的遺傳變異相當。分子系統發育分析的結果表明，長鰭犁頭鰍的個體可以形成單系，但犁頭鰍的樣本不能聚為單系，犁頭鰍的部分樣本與長鰭犁頭鰍具有更近的親緣關系。這兩個物種是否均為有效種，僅用遺傳差異的大小是不能界定物種的，因為不同類群的物種間及不同基因間遺傳差異變異的范圍很大。另外，物種的劃分也不能簡單地以分支關系來處理（Xia et al, 2005）。長鰭犁頭鰍和犁頭鰍在形態上存在顯著的區別特征：長鰭犁頭鰍偶鰭均較長，體長為胸鰭長的4.1～4.8倍（VS. 6.5～7.9倍），為腹鰭長的4.8～5.7倍（VS. 6.5～8.3倍）；腹鰭末端接近或稍為超過肛門（VS. 腹鰭末端伸至腹鰭腋部至臀鰭起點間的中點）；肛門約在腹鰭腋部至臀鰭起點間的2/3稍后（VS.約在腹鰭腋部至臀鰭起點間的2/3處）（Chen & Tang, 2000）。另外，我們對所研究樣本的體色體斑進行了檢視，發現長鰭犁頭鰍樣本較為單一，而犁頭鰍樣本變異較大。長鰭犁頭鰍樣本的體色均為棕黑色，橫跨體背部具7～8個橢圓形的大斑塊，被窄小的淺黃色條紋隔開；犁頭鰍樣本的體色從淺黃色到棕黑色，背部斑紋有的為褐色的橢圓形斑塊，有的呈圓形眼斑，有的為不規則斑紋，有的斑紋不明顯。這兩個物種在形態上存在顯著的區別特征，分布區也不重疊，因此我們認為這兩個物種均為有效種。目前的分子數據表明，這兩個物種間的遺傳差異極小，我們推測，長鰭犁頭鰍可能是新近分化出來的一個物種。環境的改變導致犁頭鰍的一個地理種群在形態上發生迅速改變，但在遺傳上還沒有足夠長的時間來積累其遺傳差異。魚類中還有很多在形態上存在差異但在遺傳上差異卻不明顯的例子，尤其在非洲湖泊的麗魚中這種現象更為普遍，盡管這些魚類之間的遺傳差異較小，但都是有效種（Meyer et al, 1990; Wilson et al, 2000）。

3.2 犁頭鰍屬魚類的物種分化過程

犁頭鰍廣泛分布于長江中上游水域，之前所記錄的分布范圍是長江水系的湖南洞庭湖至四川境內。郭治之和劉瑞蘭（Guo & Liu, 1995）、張鶚等（Zhang et al, 1996）發現在江西鄱陽湖水系的信江中也有犁頭鰍的分布。長鰭犁頭鰍局限分布于福建閩江水系。信江發源于浙贛兩省交界的懷玉山南的玉山水和武夷山北麓的豐溪水，閩江水系發源于武夷山東南。因此，武夷山是長江中下游鄱陽湖水系與閩江水系的天然分水嶺。本研究中犁頭鰍和長鰭犁頭鰍單倍型之間的遺傳差異為0.2%～1.8%，按cytb基因在淡水魚類中進化速率為每百萬年1%計算（Durand et al, 2002），犁頭鰍和長鰭犁頭鰍發生分歧的時間在0.9～0.1百萬年前，屬于更新世。根據犁頭鰍屬魚類目前的分布模式，其分布格局的形成有兩種可能的途徑：一種途徑為信江和閩江曾經相連接，犁頭鰍屬魚類曾經廣布，武夷山的隆升才造成它們的隔離；另一種途徑為，第四紀冰期海平面下降后，長江流域的犁頭鰍順長江口的水系進入閩江。由于犁頭鰍和長鰭犁頭鰍的遺傳分化很小，說明其隔離的時間很晚。武夷山的隆升相對久遠，造成的隔離應該比較大（Liu, 1984），第四紀冰期的發生則較為晚近。因此，對于犁頭鰍屬魚類的分布，第四紀冰期的擴散更有可能。

圖 3 基于cyt b基因構建的犁頭鰍屬魚類單倍型間的分子系統發育關系Fig. 3 The molecular phylogenetic trees of the haplotypes identified from the genus Lepturichthys species

綜合本文的研究結果以及歷史資料，本文對犁頭鰍屬魚類的物種分化過程作如下推測：青藏高原的隆升及東亞季風氣候的形成，使犁頭鰍屬這類適應激流環境的魚類衍生出來，廣泛分布于長江水系。在第四紀冰期全球氣溫下降，海平面降低，較現在下降超過100 m，東海大陸架露出海面成為陸地，部分水系可能相互貫通（Li & Fang, 1990）。分布于長江中下游的犁頭鰍逐漸擴散至東南沿海各水系。在間冰期，全球氣候變暖，海平面上升，大陸架被海水淹沒，各沿海水系被隔離。犁頭鰍屬于產漂流性卵的魚類，在產卵場的下游需要有足夠長的河道才能滿足受精卵漂流孵化的時間要求。因此，犁頭鰍只在少部分水系中被保留下來，如閩江水系。由于閩江水系環境的差異，擴散到閩江水系的犁頭鰍快速地發生一些分化以適應新的環境，從而分化形成長鰭犁頭鰍。相對說來，長鰭犁頭鰍表現出較低的遺傳多樣性，而分布廣泛的犁頭鰍則具有更為豐富的遺傳多樣性，且形成一個并系。

在本研究中，我們推測犁頭鰍的擴散路徑是從長江中下游經沿海大陸架向南進行擴散的。采用沿海大陸架作為遷移路徑的例子在其他動物中也有報道，如長江下游四大家魚向珠江流域、海南島等地的擴散（Li & Fang, 1990），淮河過渡動物群的南遷（Cai, 2002）等。在第四紀大冰期期間，各物種向南遷移到“避難所”的現象是較為普遍的，而沿海大陸架是物種向南遷移的一個主要路徑。

關于物種分化過程，Avise (2000)認為一般需要經歷從復系到并系再到單系3個發展階段。Zhang et al (2008）研究了采自長江的華鳈(Sarcocheilichthys sinensis sinensis) 和閩江的福建華鳈 (Sarcocheilich-thys sinensis fukiensis)這兩個亞種的物種分化，發現這兩個亞種都不能分別構成單系，而是相互混雜聚在一起形成復系。因此，推測這兩個亞種可能還處于物種分化的早期階段，這也正支持了兩者的亞種地位。另外，Zhang et al (2008）對克氏鳈(Sarcocheilichthys czerskii)和黑鰭鳈(S. nigripinnis)的物種分化過程也進行了研究，發現黑鰭鳈的一個北方種群與克氏鳈有更近的譜系關系。由此他們推測，分布于黑龍江水系的克氏鳈可能是黑鰭鳈北方種群的一個分支向中國東北擴散后分化出來的一個物種，剩下的黑鰭鳈則形成一個并系類群。Shields et al（2000）指出，北極熊由棕熊的一個種群分化成種后，剩下的棕熊種群也是形成一個并系類群。

本研究中長鰭犁頭鰍可以構成一個單系，但犁頭鰍為一并系。犁頭鰍和長鰭犁頭鰍的物種分化過程與克氏鳈和黑鰭鳈及北極熊和棕熊的物種分化過程極為相似，即一個地理種群為適應新的環境而演化成另一個物種，從而使得原來物種的其他地理種群形成一個并系，它們在遺傳上還沒有完全分化成兩個獨立的物種，還處于物種分化的并系階段。而上面所提及的華鳈和福建華鳈則還處于復系這一物種分化的起始階段。因此，本文的研究結果進一步證實和豐富了物種形成的地理隔離過程假說。

致謝：感謝浙江大學的周卓誠先生、武漢中國地質大學的黃偉先生、中科院水生生物研究所的曾燏博士和熊玉宇博士在收集樣本上給予的幫助。另外，本所的劉思情和周健同學在實驗上也提供了大力支持，在此一并表示衷心的感謝。

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Geographical Speciation Process of the GenusLepturichthys(Cypriniformes: Balitoridae)

TANG Qiong-Ying1, YU Dan1, YANG Jin-Quan2, LIU Huan-Zhang1,*

(1.The Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation, Institute of Hydrobiology, the Chinese Academy of Sciences, Wuhan430072,China; 2.Laboratory of Fishes, Shanghai Ocean University, Shanghai200090,China)

The genusLepturichthysis endemic in China, including two valid species,L. fimbriataandL. dolichopterus. The former is widely distributed in the Upper and Middle Yangtze River, while the latter only in Minjiang River. In the present study, the mitochondrial cytochromebgene sequences were analyzed for 20 individuals ofL. fimbriatacollected from the Upper and Middle Yangtze River and eight individuals ofL. dolichopteruscollected from Minjiang River. This paper aimed to investigate the geographical speciation process of the genusLepturichthys. The results showed that the genetic variations among different haplotypes ofL. fimbriataranged from 0.1% to 1.8%, with an average of 0.7%, and from 0.6% to 1.3%, with an average of 0.7% among different haplotypes ofL. dolichopterus. The variations betweenL. fimbriataandL. dolichopteruswere also very low, ranging from 0.2% to 1.8%, with an average of 0.9%. Two methods, Neighbor Joining (NJ) and Bayesian analysis (BI), were used for constructing the molecular phylogenetic trees. Both NJ and BI trees indicated that allLepturichthysspecimens formed as a monophyletic group; theL. dolichopterussamples also formed as monophyletic group, having a derived position in the phylogenetic trees, while theL. fimbriatasamples formed as a paraphyletic group. BothL. fimbriataandL. dolichopterusare valid species in morphology. Based on molecular and morphological data, we presumed that the geographical speciation process of the genusLepturichthyscould be as following: during the Quaternary Glacial period,L. fimbriatain the Middle and Lower Yangtze River dispersed to the drainages of Southeast China along the Continental Shelf of East China Sea, one population spread to the Minjiang River and envolved as a new species (L. dolichopterus) because of considerable environmental difference, while the remainingL. fimbriatapopulations in the Yangtze River formed as a paraphyly. The other similar geographical speciation patterns are discussed in the present study as well.

book=3,ebook=136

Lepturichthys; Geographical speciation; Continental shelf of East China Sea; Yangtze River; Minjiang River

Q959.483; Q349

A

0254-5853-(2010)03-0230-09

10.3724/SP.J.1141.2010.03230

2009-10-10；接受日期：2010-03-01

國家自然科學基金資助項目(30700072；40432003)；美國自然科學基金資助項目CToL?

Corresponding author)，Tel：027-68780776，E-mail：hzliu@ihb.ac.cn