用于研究快速掃視對瞳孔光反射調制作用的新方法

陳祖躍，胡英周，張玉華，姜慧慧，胡新天,*

(1. 中國科學院昆明動物研究所 靈長類感覺、運動及整合實驗室，云南 昆明 650223；2. 中國科學院研究生院， 北京 100049；3. 中國科學院生物物理研究所 腦與認知國家重點實驗室，北京 100101)

用于研究快速掃視對瞳孔光反射調制作用的新方法

陳祖躍1,2，胡英周1,2，張玉華1,3，姜慧慧1,2，胡新天1,3,*

(1. 中國科學院昆明動物研究所 靈長類感覺、運動及整合實驗室，云南 昆明 650223；2. 中國科學院研究生院， 北京 100049；3. 中國科學院生物物理研究所 腦與認知國家重點實驗室，北京 100101)

瞳孔與光反射系統和快速掃視系統在解剖學和功能上都有著緊密聯系，但是快速掃視系統對瞳孔的光反射系統是否有調制作用尚無報道。研究這兩個系統間的調制作用，必須了解光刺激不均勻和近反應對瞳孔直徑變化是否有影響。該研究以人為被試，設計了一種全新的實驗方法，研究光刺激不均勻和近反應對瞳孔直徑變化的影響。實驗方法：將被試的一只眼用密閉的眼罩罩住給予脈沖光刺激，刺激由位于眼罩內全視野范圍水平排列的一排發光二極管(light emitting diodes，LEDs)給出，被試的另一只眼用來記錄眼動和瞳孔直徑的變化，研究水平方向的快速掃視對瞳孔對光反射時瞳孔直徑變化的影響。實驗結果：比較被試注視視野內不同位置的瞳孔對光反射相對收縮率無顯著差異（P=0.148, 非配對樣本t檢驗）。結論：該方法消除了光刺激不均勻和近反應對瞳孔直徑變化的影響，可用于研究快速掃視系統對瞳孔光反射系統間的調制作用。

快速掃視；瞳孔對光反射；調制

快速掃視（saccade）是一種常見的視線轉移運動(Fuchs et al, 1985; Carpenter, 1991)，瞳孔對光反射(pupillary light reflex, PLR)是由于進入視網膜的光亮度的變化而引起瞳孔的直徑改變(Yoshitomi & Ito, 1986; Wilhelm, 2008)。快速掃視系統和瞳孔對光反射系統間存在著緊密的解剖學和功能上的聯系(Kawamura et al, 1974; Akert et al, 1980; Burde & Loewy, 1980; Gamlin et al, 1995)，這兩者之間是否存在調制關系尚未見報道。研究它們之間的調制關系不僅有助于進一步了解這兩個系統的神經通路和系統間的作用方式，而且對了解腦內其它系統的相互作用并最終了解腦的工作機理有重要意義。

研究快速掃視系統對瞳孔光反射系統的調制作用的最大的困難在于實驗方法，方法中所用的光刺激不能影響瞳孔大小。光刺激方式會影響瞳孔大小的變化，視野內不同位置的光刺激引起的瞳孔大小變化也不同：相同亮度的環境光刺激視網膜黃斑外的區域時引起的瞳孔對光反應的閾值要比刺激黃斑區時引起瞳孔對光反應的閾值要低；刺激黃斑區引起的瞳孔對光反射的幅度要比刺激黃斑區外引起的瞳孔對光反射的幅度要大(Pong & Fuchs, 2000; Clarke et al, 2003)。消除這種影響的辦法是保證在實驗過程中進入黃斑區和黃斑區外的光是均勻的；其次是近反應（the near response）也會影響瞳孔的大小 (Suzuki, 2007)：當被試注視一個由遠到近的視覺目標時，瞳孔會發生收縮，反之瞳孔會增大，說明瞳孔大小與注視目標的距離遠近有關(Myers & Stark, 1990)，所以在設計實驗時要使所有刺激光點距離眼球的距離相等。

快速掃視是一種雙眼協同的聯合運動；瞳孔對光反射具有互感性，即光刺激一只眼可以引起雙眼的瞳孔收縮。根據這兩種特性，我們設計了一種新的實驗方法，擬用于研究水平方向的快速掃視對瞳孔光反射是否有調制作用。本研究驗證了這種方法是否能有效地排除上述光刺激不均勻和近反應對瞳孔大小的影響，為此比較了被試注視視野內鼻側10°和顳側10°時瞳孔對光反射的瞳孔收縮相對率。

1 方 法

1.1 被 試

參與此實驗的被試5人，年齡20—30歲之間，平均年齡25.4歲。被試視力或矯正視力正常，能夠清晰地分辨屏幕上視角為1°大小的刺激點的位置。實驗時被試的精神狀態良好。在安靜環境中完成此實驗。

1.2 儀器和設備

本實驗所使用的記錄裝置為美國ASL公司（Applied Science Laboratories, U.S.A.）生產的紅外眼動儀（型號：RS6-HS），采樣率為120 Hz。

1.3 刺激裝置

刺激是通過戴在一只眼睛上的眼罩內的發光二極管（light emitting diodes，LED）給出，另外一只眼用來記錄瞳孔直徑大小和視線的位置（圖1）。眼罩為半球形，眼罩的直徑為10 cm。為了保證在水平方向上進入視網膜外周和黃斑區的光刺激強度一致，在眼罩的內面焊接有12個亮度相對比較均勻的LED：在相距5 cm時，在3 V固定電壓下用照度計測量單個LED亮度為(42.13±1.76) lx，相對變化率小于4%。這12個LED沿眼罩內面呈弧形水平排列，每個LED距眼球的距離相等，以減少近反應對瞳孔大小的影響。通過與刺激計算機并口相連的放大電路給LED供電。所給刺激為脈沖光，每個脈沖光刺激持續時間為100 ms。脈沖刺激之間的間隔時間在3—5 s范圍內隨機。從供電的計算機并口分出一條數據線與記錄數據的計算機相連，將刺激信號導入到記錄文件中。

圖 1 刺激呈現方式和記錄方法示意圖Fig. 1 A diagram illustrating the way of stimulus presentation and the recording method

1.4 數據采集

被試下頜置于固定的下巴托上，以保持頭部固定。前方約42 cm處放置紅外攝像頭記錄其眼球的運動和瞳孔的直徑（圖1）。數據由ASL眼動儀器自帶的采集軟件采集。數據中包含有記錄時間、刺激信號、眼球水平位置、垂直位置和瞳孔大小等信息。處理和分析在Matlab7.6下完成。

1.5 眼睛注視位置校準和數據處理

在分析前需要對實驗中所涉及的眼睛注視位置和瞳孔直徑兩個變量進行校準和處理。

為了將記錄的相對位置轉化為絕對位置，采用9點法對眼睛注視位置進行校準：在被試前方171 cm處放置一個屏幕，上面有3×3個視角大小為1°的點，相鄰兩點的水平間距為46 cm，視角為15°，垂直間距為25.5 cm，視角為8.5°。實驗前讓被試在明亮環境下依次注視這9個點，并記錄下被試注視每個點時的坐標。根據這9個點位置關系可將實驗中記錄到的被試的注視點位置轉換為絕對位置。

由于眼睛注視位置變化曲線會產生波動。為了確定在瞳孔對光反射過程中是否有快速掃視發生，首先對眼睛注視位置變化曲線進行濾波，其方法是采用五點中央平均濾波器（a five-point central averaging filter）濾波。濾波后信號乘以采樣率后再微分，得出每一時刻的眼動速度。然后從微分后的結果中挑出速度大于或等于30°/s數據點。連續有3個數據點大于或等于30序列，就視為一次快速掃視過程。

1.6 瞳孔直徑校準和數據處理

為把瞳孔相對直徑轉換為絕對直徑并驗證測量結果的可靠性，需要對瞳孔直徑做校準，其校準方法是將模擬瞳孔固定在一個可以沿水平方向旋轉的底座上，旋轉臂的長近似于人的眼球的平均半徑。將底座置于下巴托上，使模擬瞳孔和被試眼球保持在同一位置。模擬瞳孔正視攝像頭時的角度為0°。記錄模擬瞳孔注視0° 和左右兩側5、10、15、20和25° 的瞳孔直徑大小。在黑暗條件下，讓被試也注視視野內水平方向上不同位置，記錄真實瞳孔注視視野中心和左右兩側不同位置時的瞳孔直徑大小。把記錄的模擬瞳孔和真實瞳孔直徑大小對注視位置作圖，得出模擬瞳孔和真實瞳孔直徑隨注視位置變化關系圖（圖2）。從圖中可以看出，真實瞳孔直徑大小隨注視位置變化與模擬瞳孔直徑的變化趨勢不同。在注視點靠近視野中央時兩條曲線基本重合，當注視點向視野兩側移動時，兩條曲線逐漸發生分離。這說明實驗中可能有不明因素造成了被試瞳孔大小的變化。為減少這種影響，將挑出的快速掃視范圍限定在視野中心兩側10° 以內。在這個范圍內，在5個對應注視位置對每名被試的瞳孔直徑大小的分布與模擬瞳孔直徑進行逐個比較，模擬瞳孔直徑大小始終落在被試瞳孔直徑大小分布的71%以內。這說明在這個范圍可以認為被試的瞳孔直徑變化和模擬瞳孔是一致的。

模擬瞳孔的大小是固定的，但是記錄出來的模擬瞳孔直徑大小卻是隨注視點變化的，其變化趨勢是一條近似的二次函數曲線。這是因為當模擬瞳孔注視視野中心時，瞳孔在攝像頭上的投影是圓形，記錄的瞳孔直徑是圓的直徑（R2）；而在注視視野兩側時，瞳孔在攝像頭上的投影是一個橢圓，記錄的直徑就相當于橢圓短軸長的2倍（R1, R3）（圖3）。為減少注視位置對瞳孔測量值的影響，需要將注視視野兩側時的直徑測量值轉化為注視視野中心時的直徑大小。具體方法是：先對模擬瞳孔直徑變化曲線進行二次擬合，根據這種函數變化關系將真實瞳孔注視視野兩側時的測量值轉化為注視視野中心時的直徑大小。

圖 2 被試瞳孔和模擬瞳孔在注視水平不同位置時瞳孔直徑大小比較Fig. 2 The relationship between the pupil diameters of eyes/model pupil and fixation positions

為了減少瞳孔括約肌震顫和儀器不穩定性造成的瞳孔直徑大小的波動，對上述處理后的被試瞳孔直徑采用低通濾波，濾去頻率為10 Hz以上的成分。濾波后的瞳孔信號用于進一步的統計和分析瞳孔的收縮狀況。

由于不同個體的瞳孔直徑不同，用相對收縮率（relative constriction ratio）來衡量瞳孔收縮狀況。收縮前的瞳孔直徑為刺激前10個數據點（約83 ms）、刺激呈現時刻、刺激呈現后10個數據點（約83 ms）的瞳孔直徑的平均值。瞳孔的收縮幅度為收縮前的瞳孔直徑和收縮后的瞳孔直徑的最小值之差。相對收縮率等于收縮幅度除以收縮前的瞳孔直徑乘以100%后的值。

1.7 方法有效性驗證

為了驗證光刺激是否均勻，以及在±10° 內眼睛位置是否對瞳孔的對光反射有影響，我們設計了以下實驗：實驗前在明亮環境下，在被試視野中心鼻側和顳側10° 的兩個點呈現光刺激，讓被試記住兩個點。然后在黑暗條件下，讓被試在這兩個點間隨意做快速掃視，記錄被試注視這兩個點時的瞳孔對光反射。每次實驗做7 min，前2 min不給光刺激，只讓被試在兩點間做快速掃視，后5 min為光刺激條件下的實驗，通過眼罩給光刺激。兩次實驗之間讓被試休息5 min。每天完成4次實驗（左右眼各兩次實驗），每個被試做5 d。然后比較被試注視視野左右兩側時的瞳孔相對收縮率。如果我們所用的光刺激是不均勻的或單個的LED距眼球距離不等，那么被試在注視視野兩側時視網膜接受的光刺激是不一樣的，就會造成瞳孔對光反射的差異；如果光刺激是均勻的或LED距眼球距離相等，那么就不會造成瞳孔對光反射的差異。

圖 3 模擬瞳孔注視視野內不同位置時，攝像頭所測得的瞳孔大小不同Fig. 3 A diagram illustrating the difference of the model pupil diameter when the subject fixated at different positions in visual field

根據刺激將每次實驗分成若干次瞳孔反應：以刺激呈現時刻為標記點，一次瞳孔反應的時間為刺激前160 ms到刺激呈現后2 000 ms的時間。統計每次瞳孔反應時的瞳孔直徑相對收縮率。實驗結果用SPSS軟件包（SPSS 13.0 for windows）進行分析，注視視野兩側時的瞳孔對光反射的相對收縮率的比較采用非配對樣本t檢驗。

2 結 果

在有效性實驗驗證中，我們將鼻側和顳側10°的兩個點的窗口設為2°，即當被試的視線在一個瞳孔對光反射周期內始終停留在(10±2)° 范圍內，并且沒有快速掃視出現，就認定為一次注視狀態下的瞳孔對光反射。從5個被試的7 500次的瞳孔反應中，我們挑出了符合條件的71次注視顳側視野時瞳孔對光反射的瞳孔反應，83次注視鼻側視野時瞳孔對光反射的瞳孔反應。統計每位被試在注視鼻側和顳側10° 時瞳孔相對收縮率發現，注視顳側視野時瞳孔對光反射的相對收縮率為（18.04±0.43）%，注視鼻側視野時瞳孔對光反射的相對收縮率為（18.14±0.44）%，瞳孔相對收縮率并沒有表現出顯著差異（P=0.148, 非配對樣本t檢驗）。表明所用的光刺激是均勻的，LED距眼球距離是相等的。

3 討 論

調制作用是神經系統中一種普遍的作用方式(Shors et al, 2000; Nunez & Malmierca, 2007)。瞳孔光反射回路位于腦干，快速掃視也可以由其腦干中樞獨立完成，研究瞳孔光反射系統和快速掃視系統間調制作用有助于解釋皮層以外的調制作用是如何發生的，但在研究方法上要求排除與眼動有關的一些因素對瞳孔大小的影響。本方法所用的光刺激是均勻的，且LED距眼球距離相等，可滿足此要求。首先，用于給光刺激的LED亮度差異較小，而且是均勻整齊地排列在眼罩內，保證了進入黃斑區和黃斑區外的光的分布是均勻的。LED所在球面與眼球共球心，保證了每個LED與眼球的距離是一樣的，從而排除近反應對實驗結果的干擾。為了驗證本方法排除上述干擾因素影響的有效性，我們比較了5名被試注視視野內鼻側和顳側距中心10°時的瞳孔對光反射情況，結果顯示注視兩側視野時瞳孔相對收縮率并無顯著差異，這說明我們的方法是可行的。

比較模擬瞳孔和真實瞳孔發現，在沒有快速掃視的情況下，瞳孔直徑隨注視位置變化趨勢是不一樣的。這說明環境中有不明因素造成了被試瞳孔直徑的變化，這種因素可能是來自攝像頭的紅外光源引起了瞳孔的變化，被試的心理狀態可能也會影響實驗的結果。為了減少這種影響，從實驗中選取的被試快速掃視范圍限定在視野中心±10° 內。在這個范圍內，模擬瞳孔直徑大小始終落在被試瞳孔直徑大小分布的71%以內，可以忽略被試和模擬瞳孔的直徑變化差異。另外當注視點偏離視野中心越大，眼動儀器的穩定性越差，丟失的數據也就越多，限定快速掃視的范圍可以增加有效實驗的次數。

我們采用這種方法記錄了5名被試的瞳孔對光反射，從記錄結果中能夠提取快速掃視的方向、一個瞳孔對光反射周期內出現快速掃視的次數、快速掃視的幅度、快速掃視在一個瞳孔對光反射周期內出現的時間等信息，在此基礎上可進一步研究兩個系統間的調制作用。改變眼罩內LED的排列方式可以研究其他方向上的快速掃視對瞳孔對光反射的調制作用。

Akert K, Glicksman MA, Lang W, Grob P, Huber A. 1980. The Edinger-Westphal nucleus in the monkey. A retrograde tracer study [J].Brain Res, 184(2): 491-498.

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A New Method to Explore the Modulation from the Saccadic System on the Pupillary Light Reflex System

CHEN Zu-Yue1,2, HU Ying-Zhou1,2, ZHANG Yu-Hua1,3, JIANG Hui-Hui1,2, HU Xin-Tian1,3,*

(1.Laboratory of Sensory-motor Integration Research, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming650223,China;
2.Graduate University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing100049,China;
3.State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science, Institute of Biophysics, the Chinese Academy of Sciences, Beijing100101,China)

The saccadic system has anatomical and functional connections with the pupillary light reflex (PLR) system. But it is not known whether the saccadic system modulates the PLR system. To investigate this issue, it is necessary to understand whether the uneven light stimulus to retina and the near responses influence the change of pupil diameter. We designed a new behavioral method to investigate the issue on human subjects. Methods: one eye of the subject was stimulated by pulse light stimulus from a horizontal linear array of light emitting diodes (LEDs) presented across visual field in an ocular mask. The changes of the eye position and pupil diameter of another eye were recorded by an infrared eye tracking system. Results: The relative constriction ratios of PLRs on the condition that the fixation points of subjects were in the nasal visual field were not significantly different from that the fixation points of subjects were in the temporal visual field（P=0.148, non-pairedttest）.Conclusion: The influences from uneven light stimulus to retina and the near responses were eliminated by this method. The method can be used to study the modulation from the saccadic system on the pupillary light reflex system.

Saccade; Pupillary light reflex (PLR); Modulation

R339.143；Q436

A

0254-5853-(2010)03-0287-05

10.3724/SP.J.1141.2010.03287

2009-11-12；接受日期：2010-05-10

CASC項目（YZ200737）

*通訊作者（Corresponding author），E-mail：xthu@mail.kiz.ac.cn

E-mail：chenzuyue@gmail.com