萼花臂尾輪蟲種復合體遺傳分化的空間格局

項賢領, 席貽龍, 溫新利, 張晉艷, 馬 芹

（安徽師范大學 生命科學學院；安徽省高校“生物環境與生態安全”省級重點實驗室，安徽 蕪湖 241000）

萼花臂尾輪蟲種復合體遺傳分化的空間格局

項賢領, 席貽龍*, 溫新利, 張晉艷, 馬 芹

（安徽師范大學 生命科學學院；安徽省高校“生物環境與生態安全”省級重點實驗室，安徽 蕪湖 241000）

對采自中國東部8個地理區域中的萼花臂尾輪蟲種復合體（Brachionus calyciflorusspecies complex）內124個輪蟲克隆的核DNA ITS區進行了測序和分析，重建了萼花臂尾輪蟲種復合體的系統發生樹。研究發現，73個單倍型聚合為3個支系，支系間序列差異百分比為4.2%～25.3%，表明萼花臂尾輪蟲實際上是由3個隱種組成的種復合體，在廣州、儋州和蕪湖采樣點均具有隱種共存現象。萼花臂尾輪蟲種復合體的核苷酸多樣性和單倍型多樣性均較高，隱種Ⅲ內各種群間遺傳分化指數也較高，這可能是由于棲息地片段化和有限的基因流導致的。另外在冰期瓶頸后拓殖種群的快速增長也阻礙了有效基因流，并加速了地理種群間的遺傳分化。巢式支系分析顯示部分巢支具有一定的系統地理格局，而Mantel檢驗表明，種群間平均凈遺傳距離及遺傳分化指數和地理距離間均無顯著相關性。末次盛冰期之后的新仙女木事件（Younger Dryas Event，YD）可能對我國萼花臂尾輪蟲隱種的分布和地理格局造成較大影響。在YD時期，3個萼花臂尾輪蟲隱種可能退縮并共存于南嶺以南地區的多個殘遺種避難所，而此后的休眠卵長距離拓殖并伴隨后期的棲息地片段化可能是形成當前地理格局的主要原因。萼花臂尾輪蟲種復合體在全球范圍內的地理分布可能與大陸板塊構造運動有關。

萼花臂尾輪蟲；種復合體；遺傳分化；空間格局；巢式支系分析；系統地理學

系統地理學是研究物種及物種內不同種群形成現有分布格局的歷史原因和演化過程的一門學科，其研究的核心是遺傳譜系空間分布的歷史特征（Avise & Hamrick, 1996）。通過對種群遺傳結構的分析來探討種內系統地理格局的形成機制、系統發育關系以及現有分布特征，并結合種群的地理分布狀況來發現和驗證與其相關的地質事件，追溯和揭示種群的進化歷程（Avise et al, 1987; Avise, 1998），這對理解種群分化、物種形成、生態適應和歷史氣候變化等進程具有重要意義（Avise, 2000）。生物體分布格局的形成原因不僅包括生物因素（如擴散、適應、物種形成、滅絕以及生物之間的相互作用等），還應當包括地理歷史因素（如板塊構造運動、海平面升降、氣候變化和海洋洋流變化等）（Chen et al, 2006）。山脈、河流等自然地理條件對生物擴散具有一定的隔離屏障作用，維持甚至加速了種群的局域性分化（Hebert et al, 2003; Taylor et al, 1998; Cox & Hebert, 2001）。地理歷史上的拓殖事件以及物種分布區的擴張或退縮也會對種群的遺傳結構產生重要影響。我國是惟一跨越六大動物地理區（古北界、新北界、舊熱帶界、東洋界、新熱帶界和澳洲界）中兩個主要地理區（古北界與東洋界）的國家, 加之地處歐亞大陸東南端，地球地質歷史上的一些重大事件（如印度板塊與歐亞板塊的碰撞、青藏高原的隆起以及末次盛冰期以來的新仙女木事件等）都對我國的氣候和動物地理分布產生直接影響，使得我國成為研究世界動物區系演化與生物地理學的關鍵地區之一（Miao et al, 2003）。

目前，系統地理學研究主要集中在對高等動植物系統地理格局的分析上（Taberlet & Bouvet, 1994; Johnson et al, 1999; Fernando et al, 2000; Edwards & Gadek, 2001），而關于浮游動物系統地理學的研究僅局限于枝角類溞屬（Daphnia）（Hebert, 1987; Innes, 1991; De Meester, 1996; Vanoverbeke & De Meester, 1997; Weider et al, 1999a, b; Hebert et al, 2003; Penton et al, 2004; De Gelas & De Meester, 2005）、褶皺臂尾輪蟲種復合體（Brachionus plicatilisspecies complex）（Gómez et al, 2000, 2002a, b; Gómez, 2005; Mills et al, 2007）和螅狀獨縮蟲（Miao et al, 2003），其中的原因除了長期以來認為大多數浮游動物種群可以休眠體形式通過風力、水流和水禽等介質傳播而形成全球性分布以至于不存在地理分化外，還由于浮游動物個體小，尋找不同種群間形態結構差異相對比較困難（Miao et al, 2003）。迄今為止，關于浮游動物的系統地理格局主要包括以下兩種不同的觀點：一種觀點認為少數有建群效應的休眠體在經歷了歷史拓殖事件后，種群會有一個快速增長期，從而有效阻止了由基因流引起的等位基因頻率的變化（Boileau et al, 1992）。此外，這些定殖種群對棲息地環境的快速適應（De Meester, 1993, 1996; Okamura & Freeland, 2002）以及它們所擁有的龐大的休眠卵庫（Hairston, 1996）均進一步強化了建群效應的持久性。因此，這些種群表現出高度的遺傳分化和顯著的系統地理格局（Gómez et al, 2000, 2002a, b, 2007; Gómez, 1997, 2005; Hebert, 1998; Mills et al, 2007），種群間的遺傳距離隨著地理距離的增加而增加。這些進程已由De Meester et al（2002）整合定名為“獨占假說”；另一種觀點認為由于浮游動物在整個休眠卵階段具有高度的擴散能力，休眠體的長距離拓殖限制了種群分化和局域性適應，從而使得種群間遺傳距離比期望值小，遺傳多樣性降低，無法形成系統的地理格局，種群間遺傳距離和地理距離間沒有顯著的相關性（Weider et al, 1999a; Innes, 1991; Dong & Niu, 2004; Mergeay et al, 2005; Ishida & Taylor, 2007; Mu?oz et al, 2008）。

浮游動物多樣的地理分布格局可能與其隱種混雜和季節替代有關。大多數浮游動物都具有高度的擴散能力和廣泛的地理分布（Hebert, 1987; Ruttner-Kolisko, 1974; Koste, 1978; Wallace & Snell; 2001），廣布種在其分布區常常表現出廣泛的形態變異，如高度的表型可塑性或周期變形，以及由于高度的形態停滯而引起的形態學一致性（De Gelas & De Meester, 2005），這些均會導致我們對隱性物種形成的忽視（Hutchinson, 1967; Knowlton, 1993; Hebert, 1998），從而使得許多物種的確定可能存在錯誤。近期的分子系統學研究表明，這些在較大地理尺度上分布的廣布種，尤其是來自不同大陸的地理種群間存在多個遺傳譜系或隱種（Taylor et al, 1998; Gómez et al, 2000, 2002b; Cox & Hebert, 2001; Hebert et al, 2003; Penton et al, 2004; Gilbert & Walsh, 2005），所謂的廣布種事實上可能是隱種復合體（Gómez et al, 2002b; Gómez, 2005; Gilbert & Walsh, 2005; Ciros-Pérez et al, 2001; Derry et al, 2003），即使在較小的地理范圍內，這些廣布種的地理種群間也存在高度的遺傳分化（Hebert, 1987; Carvalho, 1994; De Meester, 1996; Ortells et al, 2000, 2003; Gómez et al, 2002b; Suatoni, 2003; Gómez, 2005; Li et al, 2008）。另外，在同一水體中還存在季節種群間的遺傳分化或隱種共存（Gómez et al, 1995; Ortells et al, 2003; Cheng et al, 2008）。因此，種群遺傳結構研究中必須首先進行物種分化的相關研究，尤其是當該物種被懷疑可能存在隱種時（Ortells et al, 2003），從而避免隱種混雜和季節替代對輪蟲種群遺傳分化的空間格局分析產生干擾。

萼花臂尾輪蟲（Brachionus calyciflorus）是常見的淡水輪蟲種類之一，具有典型的周期性孤雌生殖特點，長期被看做是世界性分布的廣布種。然而，近期的研究表明，它也是一個種復合體（Gilbert & Walsh, 2005; Cheng et al, 2008; Li et al, 2008）。有關萼花臂尾輪蟲的系統地理學研究目前只涉及少數地理區域（Dong & Niu, 2004），在較大地理尺度上對其種群遺傳分化的空間格局研究尚未見報道。

為了避免輪蟲種群遺傳結構的季節變異對空間格局分析可能產生的影響，本研究選擇在各采樣點間水溫差異最小（28～35℃）時（2007年7月和8月）進行了樣品采集。以核DNA ITS序列（ITS1-5.8S-ITS2）為分子標記，對采自中國東部沿緯度梯度分布的8個地理區域的124個萼花臂尾輪蟲克隆進行測序和分析，以便我們正確認識輪蟲種群遺傳分化的空間格局和形成機制，探明輪蟲隱種同域共存的歷史原因。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和DNA提取

圖 1 萼花臂尾輪蟲種復合體采集點分布圖Fig. 1 Sampling localities for Brachionus calyciflorus species complex in this study

實驗用萼花臂尾輪蟲于2007年7—8月分別采自中國天津、德州、泰安、徐州、南京、蕪湖、安慶、南昌、贛州、廣州和儋州（圖1）。采集輪蟲樣品的同時，測定水溫、pH值和氨氮濃度等水體理化因子（表1）。樣品采集后，于各地理種群內分別挑取約200個萼花臂尾輪蟲雌體，在自然光照（光照強度約130 lx，L∶D=14∶10和與采樣點水溫相近的溫度條件下進行克隆培養。培養液采用Gilbert（1963）配方（pH=7.3），所用餌料為HB-4培養基（Li et al, 1959）培養的、處于指數增長期的斜生柵藻（Scenedesmus obliquus），培養時間在1個月以上。當各克隆輪蟲達較高密度（200～300 ind./mL）時，用輪蟲培養液過濾沖洗，饑餓24 h后用70%酒精固定保存。由于實驗室內輪蟲克隆培養難度較大，只有部分輪蟲個體的克隆培養獲得成功；贛州、南昌和泰安等3個地理種群由于僅建立1～2個克隆而未被使用，最終124個輪蟲克隆數據被納入本次分析。

用玻璃粉法提取基因組DNA（Xiang et al, 2006）。具體方法為：離心獲得輪蟲樣品，置于1.5 mL Eppendorf管中，加500 μL DNA提取緩沖液（0.5% SDS，25 mmol/L EDTA，25 mmol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）和20 μL蛋白酶K（20 μg/mL），置60℃水浴2 h；加500 μL 8 mol/L預熱后的硫氰酸胍和40 μL（1∶1）的潔凈玻璃粉乳液，混勻后置37℃水浴1 h，不時搖動；取出4 000 r/min離心2 min，棄去上清液；沉淀用70%冰乙醇清洗2次，再用丙酮清洗1次；置真空干燥機中干燥。加TE（pH8.0）40 μL，置56℃水浴30 min，取出，8 000 r/min離心2 min，吸上清液，置?20℃保存備用。

1.2 PCR擴增和測序

PCR擴增在Bio-Rad公司生產的iCycler擴增儀上進行。ITS序列（ITS1-5.8S-ITS2）引物為寶生物工程（大連）有限公司合成的LH2（5'-GTCGAATTCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA-3'）和Dlam （5'-CCTGCAGTCGACAKATGCTTAARTTCAGCRGG-3'）（Xi et al, 2003）。反應體系包括1×Buffer，0.2 mmol/L dNTP，0.2 μmol/L引物，2 mmol/L Mg2+，DNA模板4 μL，4 U的Taq酶，超純水補至50 μL。擴增程序如下：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1.5 min，72℃延伸2 min，共35個循環；最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL EB）中電泳檢測，并使用AxyPrepTMPCR純化試劑盒（AXYGEN）純化，然后連接到pMD 19-T載體（Takara）并轉化進入DH5α大腸桿菌體內。用質粒提取試劑盒提取含有目的片段的質粒DNA，ABIPRISM 3730型自動測序儀進行序列測定。

表 1 采樣點信息Tab. 1 Summary information of sampling localities in this study

1.3 數據分析

采用CLUSTAL X（1.8）軟件（Thompson et al, 1997）進行序列對位排列，并輔以人工校對；用DNASTAR軟件計算兩兩序列的序列差異百分比；再用DnaSP 5.1軟件（Librado & Rozas, 2009）分析變異位點、多態位點、簡約信息位點、單倍型多樣性（h）、核苷酸多樣性（π）和種群間平均凈遺傳距離（Da）。

為了在更大范圍內探討輪蟲譜系關系，本研究引用了GenBank中用于探討萼花臂尾輪蟲譜系關系的ITS序列，它們分別采自喬治亞（Georgia）、佛羅里達（Florida）、德克薩斯（Texas）和澳大利亞（Australia）（Gilbert & Walsh, 2005）以及中國蕪湖（Wuhu）（Zhang, 2009），序列登錄號分別為DQ071668-DQ071671和EU978878。以剪形臂尾輪蟲（B. forficula）為外群，運用PAUP*4.0b10軟件（Swofford, 2002），采用啟發式搜索的方法，分別以最大似然法（maximum likelihood，ML）、最大簡約法（maximum parsimony，MP）和鄰接法（neighbor joining method，NJ）構建系統發生樹。 采用Modeltest 3.7（Posada & Crandall, 1998）中的赤池信息準則（Akaike information criterion, AIC）檢測用于ML分析的最佳模型，模型檢測表明，最適模型為TVM+G（P＜0.001），Base = (0.2953 0.1752 0.1806)，Nst=6，Rmat=(1.1595 3.8251 2.5981 0.5005 3.8251)，Rates=gamma，Shape=0.8567。MP和NJ系統樹各結點的支持率以序列數據集1 000次重復抽樣檢驗的自引導值（Bootstrap value）（Felsenstein, 1985）表示，而ML系統樹則以100次重復抽樣檢驗的自引導值表示。貝葉斯法構建系統樹利用MrBayes 3.1.2軟件（Ronquist & Huelsenbeck, 2003）進行，其中馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法（Markov Chain Monte Carlo）設置為4條鏈（3條熱鏈、1條冷鏈）同時運行，重復一次。采用最適合的DNA進化模型TVM+G，以隨機樹為起始樹，運行6 00萬代，每100代抽樣一次，在舍棄老化樣本后，根據剩余的樣本構建一致樹，節點置信度以后驗概率（posterior probability, PP）評價。

應用Arlequin 3.1（Excoffier & Schneider, 2005）中的分子變異分析（analysis of molecular variance, AMOVA）方法檢測種群間和種群內的遺傳變異組成并估算地理種群遺傳分化指數（F-statistics，Fst）。同時，利用Arlequin軟件包中的Mantel統計學檢驗（Mantel, 1967），分別比較平均凈遺傳距離（Da）和遺傳分化指數（Fst）與地理距離矩陣之間的相關性，并進行1 000次重復的顯著性檢驗。采樣點環境因子（水溫、年平均氣溫、pH值和氨態氮濃度）與種群遺傳學參數（單倍型多樣性h、核苷酸多樣性π以及遺傳分化指數Fst）間的相關性分析采用SPSS 16.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）完成。

ITS序列單倍型之間的網絡關系用Network 4.510（Bandelt et al, 1999; available from http://www.fluxus-engineering.com）程序中的Median-Joining進行分析。這樣得到的網絡關系樹是一種無根的系統進化樹，各單倍型之間由突變連接。然后按照Templeton et al（1987）和Templeton & Sing（1993）組巢原則構建單倍型巢式支系圖：處在網絡關系樹邊緣、只與一個支系或單倍型連接的支系或單倍型稱為末支（tip clade）；而與一個以上支系或單倍型連接的支系或單倍型稱為內支（interior clade）。通常認為，在同一支系內，末支和內支分別代表了在進化上較晚和較早的支系或單倍型（Castelloe & Templeton, 1994）。組巢的基本原則是從單倍型水平開始，將末支與其相連的內支組為一個一級支系；之后再對一級支系對應的末支、內支組巢成為二級支系，直到單倍型網絡關系樹組為一個大的完整支系為止。基于巢式支系圖，進行巢式支系分析（nested clade analysis, NCA）：首先利用Geodis 2.5程序（Posada et al, 2000）計算不同支系（從一級支系到一個大的支系）內兩種類型的距離，巢內距離（Dc）表示某支系或某單倍型所有個體與該支系或該單倍型地理分布中心的平均距離，即該支系的地理分布范圍；巢間距離（Dn）表示某支系或某單倍型所有個體與包含該支系的高一級水平地理分布中心的平均距離，即該支系與進化上相近的支系間的地理分布關系；另外，在所有組巢水平各個支系內還要計算內支兩種距離均值與末支兩種距離均值之差（即各個支系內I-T的Dc和Dn）。同時，通過1 000次的隨機選擇來檢驗上述數值的顯著性大小；最后，根據上述的兩種距離結果，參照Templeton（2004）給出的對巢式支系圖不同水平支系距離格局的檢索表推測單倍型地理分布格局的歷史成因。

2 結 果

2.1 萼花臂尾輪蟲種復合體的序列變異和遺傳多樣性

萼花臂尾輪蟲種復合體內124個克隆的ITS區序列長度在759～785 bp之間，比對后長809 bp，其中變異位點253 bp，多態位點226 bp，簡約信息位點185 bp，從而定義了73個單倍型。A、T、C和G堿基平均含量分別為28.9%、36.2%、16.6%和18.3%，其中A＋T含量（65.1%）明顯高于C＋G含量（34.9%），表現出明顯的反G偏倚。儋州樣品的A+T含量稍有偏高（65.9%），C＋G含量較平均值稍微偏低（34.1%），其它各采樣點樣品間的堿基組成變化不大。所有樣品測序結果已提交至GenBank（序列登錄號GU012678-GU012801）。大部分單倍型都分布在單一采樣點中，另外有12個共享單倍型分布在兩個或兩個以上的采樣點（表2）。平均核苷酸多樣性和單倍型多樣性分別為0.0529（±0.0078SD）和0.960（±0.008SD）（表2），各采樣點樣品的核苷酸多樣性（π）與單倍型多樣性（h）之間并不呈現顯著的相關關系。廣州、儋州、南京和蕪湖樣品的核苷酸多樣性均高于平均核苷酸多樣性。對各采樣點樣品間凈遺傳距離（Da）的分析顯示，蕪湖樣品和徐州樣品與其他各采樣點樣品間具有較高的Da值（表3）。

2.2 系統發生關系

運用貝葉斯法、最大似然法、最大簡約法（未示出）和鄰接法（未示出）構建的系統發生樹的拓撲結構基本一致（圖2—3），均將73個單倍型分成3個支系：支系Ⅰ（Clade Ⅰ）、支系Ⅱ（Clade Ⅱ）和支系Ⅲ（Clade Ⅲ），且置信度較高。支系Ⅰ涵蓋的單倍型數最少（7個），全部為來自儋州采樣點的樣品；支系Ⅱ包括了13個儋州單倍型、11個廣州單倍型、2個蕪湖單倍型和1個儋州與廣州共享單倍型；剩下的39個單倍型全部歸入支系Ⅲ，分布于8個采樣點。所有73個單倍型間序列差異百分比為0%～25.3%，平均5.97%，最大的序列差異位于共享單倍型SH9和單倍型HN14間。支系Ⅰ、支系Ⅱ和支系Ⅲ內部的ITS區序列差異百分比分別為0%～1.7%、0%～0.8%和0%～2.4%；支系Ⅰ和支系Ⅱ，支系Ⅰ和支系Ⅲ以及支系Ⅱ和支系Ⅲ間的序列差異百分比分別為23.7%～25.3%、23.9%～25.3%和4.2%～6.2%。根據Gilbert & Walsh（2005）對不同地理品系萼花臂尾輪蟲的交配實驗和ITS區序列分析結果，不同地理品系萼花臂尾輪蟲間ITS區序列差異百分比大于4%時具有生殖隔離，為不同的隱種。因此本研究中的這3個支系應該屬于不同的隱種，在本文中分別臨時命名為隱種Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。

表1羅列了PISA與中考數學在不同內容主題上的分布，可清楚地得出PISA題和中考題對運算和幾何概念考察比例相差不大，不過中考題的三角幾何知識所占比例較大；PISA題的數據展示、統計和概率相加達到34%，高于中考題；另一方面，中考題包括函數的知識，而在PISA題內并未涉及，而PISA題中涉及的測量和消費者應用方面，在中考題中也未出現.表2羅列了從認知要求維度上的分布情況，可得兩者執行程序認知所占的比例都非常高，中考題涉及的回憶的知識和證明題較多，而PISA題中解決非常規問題比例較高.因此PISA題傾向與要求學生解決一些實際問題，建立數學和實際的聯系，而中考題側重考察學生對知識的掌握情況.

表 2 萼花臂尾輪蟲種復合體各采樣點的樣品數、單倍型、核苷酸多樣性和單倍型多樣性(±標準差)Tab. 2 Sample size, haplotypes, nucleotide and haplotype diversity (±SD) for each geographic population in Brachionus calyciflorus complex

表 3 萼花臂尾輪蟲種復合體各采樣點樣品間平均凈遺傳距離（Da，對角線上）和分化程度（Fst，對角線下）以及樣品內分化程度（Fst，對角線）Tab. 3 Average pairwise difference between populations (Da, above diagonal), Fst among (below diagonal) and within (on the diagonal) geographic populations in Brachionus calyciflorus complex

來自喬治亞（Georgia DQ071668）和佛羅里達（Florida DQ071669）的萼花臂尾輪蟲隱種被歸入支系Ⅲ，它們與支系Ⅲ內部各克隆間序列差異百分比為0.8%～3.2%；與支系Ⅱ間序列差異百分比為5.5%～6.7%；與支系Ⅰ間序列差異百分比為24.8%～25.6%。因此，喬治亞和佛羅里達的萼花臂尾輪蟲隱種與支系Ⅲ為同一譜系。來自中國蕪湖的萼花臂尾輪蟲隱種（Wuhu China EU978878）被歸入支系Ⅱ，其與支系Ⅱ內部各克隆間序列差異百分比為0.1%～0.5%；與支系Ⅰ內部各克隆間序列差異百分比為24.4%～25.2%；與支系Ⅲ內部各克隆間序列差異百分比為4.6%～6%。因此，中國蕪湖的萼花臂尾輪蟲隱種與支系Ⅱ為同一譜系；而來自德克薩斯和澳大利亞的萼花臂尾輪蟲隱種均作為一個單獨的支系被獨立出來，德克薩斯萼花臂尾輪蟲隱種（Texas DQ071670）與支系I、支系II和支系III間的序列差異百分比分別為25.9%～26.7%、4.5%～5.1%和3.8%～4.5%；澳大利亞萼花臂尾輪蟲隱種（Australia DQ071671）與支系I、支系II和支系III間的序列差異百分比分別為25%～25.8%、7.1%～7.8%和5.6%～6.9%。

2.3 種復合體內隱種Ⅲ的遺傳多樣性、種群遺傳分化和系統地理結構

考慮到隱種Ⅰ內僅含有儋州種群，隱種Ⅱ內含有儋州、廣州和蕪湖種群，且蕪湖種群僅有兩個單倍型（WH21和WH23）。因此，下面的種群遺傳分化和系統地理格局分析僅包括隱種Ⅲ內的6個地理種群的38個單倍型（由于儋州和廣州種群都僅含一個單倍型，因此未被包括在內）。

隱種Ⅲ的平均核苷酸多樣性和單倍型多樣性分別為(0.0096±0.0008)和(0.918±0.018)，均低于萼花臂尾輪蟲種復合體的核苷酸多樣性和單倍型多樣性，尤其是核苷酸多樣性。各種群的核苷酸多樣性（π）與單倍型多樣性（h）之間并不呈現顯著的相關關系。AMOVA分析顯示，隱種Ⅲ內各種群間具有較高的遺傳分化水平（種群間變異為32.61%，種群內變異為67.39%，Fst=0.3261）。種群間凈遺傳距離（Da）的分析顯示，徐州種群與其他各地理種群間具有很高的Da值；種群間的分化程度（Fst）也同樣遵循這種規律（表4）。

Mantel檢驗結果表明，隱種Ⅲ內各地理種群間的遺傳距離（Da）和遺傳分化程度（Fst）（表4）并不隨空間距離的增加而增大，兩對矩陣未發現有顯著的相關性（P=0.999）；萼花臂尾輪蟲種復合體的Da和Fst（表3）與各采樣點間的距離也無顯著的相關性（P=0.923）。

相關分析表明，隱種Ⅲ內地理種群的遺傳學參數（單倍型多樣性、核苷酸多樣性以及遺傳分化指數）與采樣點的環境因子（水溫、年平均氣溫、pH值和氨態氮濃度）間均沒有顯著的相關性；但采樣點的年平均氣溫與萼花臂尾輪蟲種復合體的核苷酸多樣性呈顯著正相關（r=0.720，P＜0.05），與遺傳分化指數呈顯著負相關（r=?0.717，P＜0.05）。

圖 2 基于ITS序列的萼花臂尾輪蟲種復合體的ML系統發生樹Fig. 2 ML phylogenetic tree of Brachionus calyciflorus species complex based on ITS sequences

2.4 巢式支系分析

根據組巢原則得到的萼花臂尾輪蟲種復合體內73個單倍型的巢式支系圖的拓撲結構（圖4）與貝葉斯及最大似然法系統樹（圖2—3）基本一致。73個單倍型組成了16個一級支系、6個二級支系和3個三級支系。根據Templeton et al（1992）的判斷程序，由于3個三級支系之間的分歧已超過95%的簡約性連接置信限度，因此這3個支系之間并沒有連接。

圖 3 基于ITS序列的萼花臂尾輪蟲種復合體的貝葉斯系統發生樹Fig. 3 Bayesian phylogenetic tree of Brachionus calyciflorus species complex based on ITS sequences

表 4 隱種Ⅲ內各地理種群間平均凈遺傳距離（Da，對角線上）、種群間遺傳分化程度（Fst，對角線下）、種群內遺傳分化程度（Fst，對角線）、核苷酸多樣性和單倍型多樣性Tab. 4 Average pairwise difference between populations (Da, above diagonal), Fst among (below diagonal) and within (on the diagonal) populations, nucleotide diversity and haplotype diversity in cryptic species Ⅲ

圖 4 萼花臂尾輪蟲種復合體內單倍型網絡圖和巢支設計Fig. 4 Haplotype networks and nested clade design for all unique Brachionus calyciflorus species complex haplotypes

經巢支設計，萼花臂尾輪蟲種復合體內73個單倍型組成3個網絡圖（圖4）。網絡圖Ⅰ僅由7個來自儋州的單倍型組成，其中共享單倍型SH12可能為祖先單倍型；網絡圖Ⅱ中大部分是來自儋州（13個）和廣州（11個）的單倍型，此外還有兩個來自蕪湖的單倍型和一個共享單倍型SH11；剩下的所有單倍型被歸入網絡圖Ⅲ，其中在多個采樣點間共享的單倍型SH5可能是最原始的單倍型。 3個網絡圖間具有顯著的遺傳分歧，與單倍型系統發生分析結果相一致。

巢式支系分析（NCA）得到的所有組巢水平各個支系內的內支、末支和內外支的巢內距離（Dc）和巢間距離（Dn）之差以及顯著性大小值（P）的結果見表5。單倍型分布與其地理位點間的隨機關系零假設在部分巢支中被拒絕，呈現出一定的系統地理格局。根據檢索表分析推測到的各個單倍型地理分布格局的一系列歷史成因見表6。支系2-2、2-4和3-3由長距離拓殖并可能伴隨后期的棲息地片段化形成；支系2-5，由于距離隔離情況下有限的基因流造成的；支系3-2，由于樣本量有限而無法辨別是距離隔離還是長距離擴散影響了其地理分布格局。支系3-1，由于代表的是隱種Ⅰ，且只包括一個地理種群，故無法分析其地理格局。

3 討 論

3.1 萼花臂尾輪蟲種復合體和隱種Ⅲ的遺傳多樣性

在兩個隨機選擇的DNA序列間平均每個核苷酸位點的差異數，也許更能反映種群的遺傳變異水平（Nei & Li, 1979）。單倍型多樣性和核苷酸多樣性越高，種群遺傳多樣性就越豐富。本研究中，萼花臂尾輪蟲種復合體的核苷酸多樣性較高，單倍型多樣性也很高；而萼花臂尾輪蟲種復合體內隱種Ⅲ的平均核苷酸多樣性和單倍型多樣性均低于萼花臂尾輪蟲種復合體的核苷酸多樣性和單倍型多樣性，尤其是核苷酸多樣性指數；這可能是由于萼花臂尾輪蟲種復合體已分化為3個隱種的緣故。

表 5 基于巢式支系圖（圖4），應用程序Geodis 2.5對萼花臂尾輪蟲種復合體內73個單倍型數據進行巢式支系分析（NCA）得到的有顯著差異水平的巢內距離（Dc）和巢間距離（Dn）Tab. 5 Two distances with significant difference obtained from the nested cladistic analysis (NCA) of 73 haplotypic data of Brachionus calyciflorus complex based on the nested cladogram given in Fig. 4 and Geodis 2.5 program＊

表 6 基于對萼花臂尾輪蟲種復合體內73個單倍型數據的巢式支系分析結果（表5），應用Templeton（2004）的檢索表分析得到的一系列推論Tab. 6 Chain of inference from the nested clade analysis of 73 haplotypic data of Brachionus calyciflorus complex (Tab. 5) using Templeton’s (2004) inference key

3.2 萼花臂尾輪蟲種復合體的系統發生關系

隱性物種形成在許多橈足類和枝角類等微型無脊椎動物中已被廣泛研究（Taylor & Hebert, 1992; Lee, 2000; Knowlton, 2000; Lee & Frost, 2002; Dodson et al, 2003; Penton et al, 2004; Kim et al, 2006）。此前的分子生物學研究已經表明在世界性分布的輪蟲種復合體內，核DNA ITS序列分歧較大，萼花臂尾輪蟲為4%～6.8%（Gilbert & Walsh, 2005）和5.1%～8.8%（Cheng et al, 2008），褶皺臂尾輪蟲的ITS1區間序列差異為3%～20%（Gómez et al, 2002b）。與此相似，本研究中萼花臂尾輪蟲種復合體內單倍型間序列差異百分比為0%～25.3%，平均5.97%；3個支系間序列差異百分比為4.2%～25.3%，表明萼花臂尾輪蟲實際上是一個包含3個隱種的種復合體。由于以其他種類無脊椎動物的分歧速率作為參考是不可靠的（Thomas et al, 2006），所以很難由ITS序列數據估測得到這3個隱種的分歧時間。在廣州、儋州和蕪湖采樣點發現有萼花臂尾輪蟲隱種的同域共存現象，在儋州采樣點有3個隱種同域共存（隱種Ⅰ、隱種Ⅱ和隱種Ⅲ），廣州和蕪湖采樣點各兩個隱種（隱種Ⅱ和隱種Ⅲ），其他各采樣點均只有一個隱種。

3.3 隱種Ⅲ的種群遺傳分化和系統地理結構

棲息地片段化和有限的基因流是形成當前物種分布格局的主要原因，它們可以阻礙種群間的基因交流而使其產生遺傳分化，甚至導致生殖隔離，形成新的物種。在本研究中，較高的遺傳分化指數（Fst=0.3261）表明隱種Ⅲ在各地理種群間分化顯著；根據Templeton（2004）檢索表推測到的隱種Ⅲ地理分布格局的歷史成因包括長距離拓殖并可能伴隨后期的棲息地片段化以及在距離隔離情況下的有限基因流。此外，冰期瓶頸后拓殖種群優先到達并占領棲息地，快速的種群增長阻礙了來自種群間的有效基因流，從而加速了地理種群間的遺傳分化。

有些環境因子，如水體的鹽度和水溫，對姐妹種的分布和種群的遺傳分化程度有重要影響（Gómez et al, 1995; Lowe et al, 2007; Yu et al, 2008）。運用乙酸纖維素電泳法，Gómez et al（1995）研究了西班牙卡斯特隆沿海Torreblanca濕地的3個間歇性池塘的褶皺臂尾輪蟲種群的遺傳變異，結果發現克隆群之間的生態學特性存在特化現象，且對應著特定的鹽度和溫度。在本研究中，統計學分析表明，采樣點年平均氣溫與萼花臂尾輪蟲種復合體的核苷酸多樣性指數（π）呈顯著的正相關，與遺傳分化指數（Fst）呈顯著的負相關；而其余環境因子與遺傳多樣性指數間均沒有顯著的相關性，這表明萼花臂尾輪蟲種復合體在各采樣點間的遺傳分化程度可能受到諸如氣溫等環境因子的影響。

一般來說，輪蟲、橈足類、枝角類和介形類動物均具有持久的奠基者效應、地域性的特有分布現象以及伴隨著基因流潛在減少而存在的顯著地理格局（Boileau et al, 1992; Hebert & Wilson, 1994; Weider et al, 1999a; Gómez et al, 2000; Schon et al, 2000; Mills et al, 2007），輪蟲種群的遺傳譜系間具有較強的地理空間結構，基因流小，且地理距離和遺傳距離間具有顯著的相關性（Gómez et al, 2000）。然而，Hatton-Ellis et al（1998）研究的淡水苔蘚動物Cristatella mucedo以及Dong & Niu（2004）研究的萼花臂尾輪蟲卻沒有呈現出顯著的系統地理格局。在本研究中，巢式支系分析表明，有些單倍型（如SH1、SH2和SH5）以較高的頻率在多個采樣點同時出現，這些單倍型可能是祖先單倍型，它們可能參與了冰期后的棲息地擴張，并作為奠基者在各采樣點保留下來，從而形成了相似的地理分布格局。因此，遺傳距離和地理距離間并無顯著的相關性。

3.4 萼花臂尾輪蟲種復合體的演化歷史

生物種群內和種群間的遺傳變異在地理上的分布模式一直是進化遺傳學家關注的核心問題之一（Avise, 2000）。歷史過程和環境因素均對物種分化和現有分布格局的形成具有重要影響。物種在進化史上發生的一些事件，如物種分布區的擴張與退縮、奠基者效應、生境的片段化和重大地質事件等都會對種群現存的遺傳變異水平產生影響。另外，環境因素，如山脈、河流等自然地理條件對生物擴散具有一定的隔離屏障作用，維持甚至加速了種群的局域性分化（Hebert et al, 2003; Taylor et al, 1998; Cox & Hebert, 2001）。通過比較物種間或種群間的系統地理分布模式可以勘察物種或種群進化歷史的一般模式，揭示物種或種群的進化進程（Bermingham & Avise, 1986; Hewitt, 2000）。

本研究發現，網絡圖部分巢支呈現出一定的系統地理格局，其所揭示的物種演化歷史與通過分子系統學方法得到的萼花臂尾輪蟲種復合體的遺傳分化是一致的；但是種群遺傳距離和地理距離間并無顯著的相關性。在儋州采樣點有3個隱種同域共存，而在廣州和蕪湖地區均有兩個隱種同域共存。

廣州、儋州和蕪湖地區的隱種共存可能與這些地理種群的進化歷史、擴散和適應能力有關。通過孢粉學研究發現，末次盛冰期以來的新仙女木事件（Younger Dryas Event，YD）在我國華南地區也有所表現，這一事件在歐洲、北美和我國北方都早有記載（Xiao et al, 1998）。約在10 400 a BP前后，在我國南方南嶺地區（24°15′N，115°2′E）

——廣東省和江西省的交界處（圖1陰影部分）有一次持續數百年的氣候降溫波動，但這一事件在我國南北方不同的氣候帶內的表現形式是不一樣的，南方地區不如北方地區明顯和劇烈，南方地區表現為涼、濕，而北方地區表現為冷、干，這可能與東亞季風活動效應有關（Xiao et al, 1998）。因此，本研究中的3個萼花臂尾輪蟲隱種可能是在YD時期退縮并遺存于包括儋州和廣州在內的南嶺以南地區的多個殘遺種避難所。在南嶺山地屏障阻礙下，3個隱種在儋州和廣州地區共存。新仙女木事件之后，萼花臂尾輪蟲種復合體開始向更遠的中國北方地區擴散。隱種Ⅲ的少數具有高拓殖能力的休眠體可能首先到達并占領北方各棲息地，拓殖事件之后，這些休眠體對局域環境的高度適應能力和快速的種群增長減少了來自種群間的基因流，并且有效地增加了奠基者效應的持久性，使得最初的建群者所攜帶的等位基因頻率可以延續上萬代。由于初期的拓殖者有能力快速地增長到較大的種群數量，從而在若干代以后迅速飽和被占領的棲息地并獨占特定的生態位，這樣就沖淡了后來的遷徙者的影響。在隱種Ⅲ的“優先效應（priority effects）”（Boileau et al, 1992; Mu?oz et al, 2008）作用下，隱種Ⅱ中只有兩個單倍型通過長距離擴散拓殖到蕪湖采樣點，沒有繁殖體拓殖到更遠的長江以北地區，這可能與長江的阻隔或隱種Ⅱ的擴散和適應能力較差有關。相比較而言，隱種Ⅰ僅僅分布于儋州地區，連具有相似生境特點的棲息地，如廣州地區也未能成功拓殖，這可能是由于種群過小、擴散能力差以及瓊州海峽（圖1）的屏障作用導致的。

浮游動物的世界性分布已在多個種類中被證實，這可能與其橫貫大陸的長距離擴散或拓殖能力有關（Gómez et al, 2002b; De Gelas & De Meester, 2005）。本研究發現，萼花臂尾輪蟲種復合體在全球范圍內的地理分布還可能與大陸板塊構造運動有關。中生代晚期，印度從馬達加斯加分離，正加速撞向勞亞大陸(Laurasia)。值得注意的是，此時北美仍與歐亞大陸相連，澳大利亞仍然是南極洲的一部分。因此，推測廣泛分布在我國境內的萼花臂尾輪蟲由于近似的自然地理條件和無明顯的天然阻礙可能時常與北美大陸種群間發生基因交流，并未發生隱種和種群間的遺傳分化；但由于特提斯海（Tethys sea）的阻隔，勞亞大陸和澳洲大陸間的萼花臂尾輪蟲發生了種群分化。新生代早期，印度?歐亞板塊的碰撞導致了青藏高原和喜馬拉雅山脈的隆升，使亞洲，甚至全球范圍內古地理、古氣候和生物區系格局發生了劇烈的調整，原本與南極洲相連的澳洲，此時也開始迅速向北移動，此后就再也未與其它大陸相連，因此推測澳洲板塊上的萼花臂尾輪蟲隱種即澳大利亞隱種形成的時間最早，與本研究結果吻合。此后全球大陸板塊變化較小，北美大陸和歐亞大陸的萼花臂尾輪蟲未發生隱種分化，同為隱種Ⅲ。本研究中Texas隱種、隱種Ⅰ和隱種Ⅱ的出現可能為萼花臂尾輪蟲隱種Ⅲ在北美大陸和歐亞大陸的同域性物種形成的產物。

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Spatial Patterns of Genetic Differentiation inBrachionus calyciflorusSpecies Complex

XIANG Xian-Ling, XI Yi-Long*, WEN Xin-Li, ZHANG Jin-Yan, MA Qin

(College of Life Sciences, Anhui Normal University; Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province, Wuhu241000,China)

To understand spatial patterns of genetic differentiation in theBrachionus calyciflorusspecies complex, the rDNA ITS regions of 124 rotifer clones collected from eight geographic regions in East China were sequenced and analyzed. A total of 73 haplotypes were defined, and were grouped into three clades by the phylogenetic trees. The divergences of ITS sequence among the three clades ranged from 4.2% to 25.3%, indicating the occurrence of three cryptic species (cryptic species Ⅰ, cryptic species Ⅱ and cryptic species Ⅲ). The sympatric co-occurrence of these cryptic species was observed at Guangzhou, Danzhou and Wuhu. The nucleotide diversity inB. calycifloruscomplex was higher, and so was haplotype diversity. Within cryptic species III, the higher genetic differentiation might be attributed to fragmentation and restricted gene flow. In addition, the rapid increase of colonizers after an ambiguous glacial bottleneck might interfere with effective gene flow and accelerate genetic differentiation of geographic populations. The nested clade analysis suggested to some extent the geographic structure, and the non-significant correlation existed between the geographic distance and the average pairwise difference between populations (Da) as well asFst. The Younger Dryas（YD）Event after the last full glacial period might has considerable effect on the patterns of geographic structure and distribution of crypticB. calyciflorusspecies. During the YD event, the three cryptic species probably retreated and co-occurred in multiple relict refugia to the south of Nanling area. Long-distance colonization possibly coupled with subsequent fragmentation might be the main reason of the current patterns of geographic structure. The geographic distribution ofB. calycifloruscomplex on a global scale might be attributed to the motion of continental plates.

book=31,ebook=213

Brachionus calyciflorus; Species complex; Genetic differentiation; Spatial pattern; Nested clade analysis; Phylogeography

Q349.1; Q958.12;Q178.51

A

0254-5853-(2010)03-0205-016

10.3724/SP.J.1141.2010.03205

2009-12-04；接受日期：2010-04-20

國家自然科學基金（30770352, 30499341）；安徽省優秀青年基金（08040106904）；安徽省教育廳自然科學基金（KJ2009B089Z）；“重要生物資源保護和利用研究”安徽省重點實驗室專項基金資助；安徽師范大學青年基金資助項目（2008xqn71）

*通訊作者（Corresponding author），E-mail: ylxi1965@yahoo.com.cn

項賢領（1978 - ），男，博士生，講師，主要從事分子生態學和系統地理學研究