均勻設(shè)計(jì)微波法提取玉米須中β-谷甾醇

趙文竹，于志鵬，于一丁，何帥，劉靜波

（吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室，吉林 長(zhǎng)春 130062）

均勻設(shè)計(jì)微波法提取玉米須中β-谷甾醇

趙文竹，于志鵬，于一丁，何帥，劉靜波*

（吉林大學(xué)軍需科技學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室，吉林 長(zhǎng)春 130062）

建立微波法提取玉米須β-谷甾醇的最佳提取工藝模型。采用微波萃取提取玉米須中的β-谷甾醇物質(zhì)，并通過(guò)混合因素均勻設(shè)計(jì)考察乙醇濃度，提取時(shí)間，提取功率，液固比，提取溫度和提取次數(shù)6個(gè)因素對(duì)玉米須β-谷甾醇含量的影響。通過(guò)Matlab軟件處理所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，提取時(shí)間、溫度與提取β-谷甾醇的含量成反比，乙醇濃度，液固比與提取β-谷甾醇的含量成正比，提取功率、提取次數(shù)的相關(guān)系數(shù)較小可忽略。經(jīng)軟件分析可知提取的最佳工藝為微波提取時(shí)間5 min，乙醇濃度95%，提取溫度20℃，液固比30:1（mL/g），β-谷甾醇的含量為0.24%。

紫外檢測(cè);β-谷甾醇;玉米須;微波提取；均勻設(shè)計(jì)

玉米須是傳統(tǒng)中藥，為禾本科植物玉蜀黍的花柱和柱頭。《滇南本草》（玉麥須）、《現(xiàn)代實(shí)用中藥》(玉蜀黍蕊)、《河北藥材》(棒子毛)等中醫(yī)藥典籍中都有玉米須的記載。美國(guó)食品藥品管理局[1]確認(rèn)其安全、無(wú)毒，其提取物所制藥品為非處方藥。玉米須存在多種化學(xué)成分[2]，包括氨基酸，維生素，生物堿，單寧酸，無(wú)機(jī)鹽，多糖等物質(zhì)，同時(shí)也含有大量的揮發(fā)性物質(zhì)[3]。β-谷甾醇為其有效成分之一，具有降低膽固醇[4]、抗炎、抗癌、抗氧化、防治高血壓等生理功能[5]。β-谷甾醇衍生物由于其特有的生物學(xué)特性和理化特性被廣泛的應(yīng)用[6]于醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)中。

植物甾醇是一種具有環(huán)戊烷并氫化菲結(jié)構(gòu)的物質(zhì)[7],主要存在于植物油不皂化物中,不同植物油中所含的植物甾醇是不一樣的。據(jù)來(lái)源不同也可分為植物甾醇、動(dòng)物甾醇和菌類(lèi)甾醇三大類(lèi)。天然植物甾醇種類(lèi)繁多,主要包括谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇四種[8]。植物甾醇分析可以使用高效液相色譜法[9]、氣相色譜法[10]和薄層色譜法[11]。本文采用紫外分光光度[12]測(cè)定玉米須β-谷甾醇含量。通過(guò)先進(jìn)的微波提取工藝，對(duì)玉米須樣品中β-谷甾醇提取，進(jìn)行多因素的試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，并以此得出最佳試驗(yàn)參數(shù)，確定微波提取玉米須β-谷甾醇的最優(yōu)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

β-谷甾醇：成都曼思特生物科技有限公司；氯仿、乙醇均為分析純?cè)噭罕本┗S生產(chǎn)；去離子水超純水機(jī)：美國(guó)MILLIPORE公司生產(chǎn)；752-PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)；AG204型電子天平：瑞士METTLE TOLEDO；BUCHI R-250旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：SWIZERLAND BüCHI；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、恒溫水浴鍋、循環(huán)水真空泵：鞏義市英峪高科儀器廠；微波萃取儀MAS-II：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

玉米須：由吉林大學(xué)軍需科技學(xué)營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究室提供。

1.2 玉米須β-谷甾醇的測(cè)定

玉米須β-谷甾醇含量的測(cè)定以β-谷甾醇為標(biāo)準(zhǔn)品，氯仿溶解定容后，以氯仿為空白對(duì)照液，采用紫外分光光度法測(cè)定玉米須β-谷甾醇含量。

1.2.1 玉米須β-谷甾醇最大吸收波長(zhǎng)的確定

以氯仿為空白對(duì)照，在200 nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)每隔10 nm測(cè)定一次吸光值。根據(jù)測(cè)定試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制掃描圖。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱(chēng)取18 mg β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品，用氯仿定容到10 mL為對(duì)照液（濃度為1.8 mg/mL）。用刻度移液管分別準(zhǔn)確量取對(duì)照液 0、0.3、0.5、1.0、1.2、1.5、2、2.5 mL于5 mL容量瓶中，加氯仿至刻度，搖勻。濃度分別是0、0.108、0.18、0.36、0.43、0.54、0.72、0.9mg/mL。在 243nm波長(zhǎng)下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)繪制β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 玉米須β-谷甾醇提取方法的研究

1.3.1 玉米須β-谷甾醇提取工藝流程

玉米須→精篩→清洗→晾干→粉碎→微波提取→過(guò)濾→氯仿萃取→定容10 mL→243 nm待測(cè)

1.3.2 混合因素均勻設(shè)計(jì)提取玉米須中β-谷甾醇

精密稱(chēng)取玉米須2 g，采用微波提取法[9]提取玉米須中的β-谷甾醇，分別考察微波提取時(shí)間、溫度、功率、乙醇的濃度、液固比及提取次數(shù)等6個(gè)因素，采用混合因素均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化法設(shè)計(jì)了6個(gè)因素不同水平的試驗(yàn)方案，玉米須β-谷甾醇提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸干所用溶劑，用氯仿萃取后定容于10 mL容量瓶。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 因素水平表Table 1 The level of the factor

1.4 玉米須中β-谷甾醇定性測(cè)定

1.4.1 化學(xué)試劑特征顯色法

β-谷甾醇可以用化學(xué)試劑特征顯色法進(jìn)行定性分析[13]。本文采用β-谷甾醇遇濃硫酸特征顯色反應(yīng)驗(yàn)證提取液中β-谷甾醇的存在。以β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，分別取均勻設(shè)計(jì)的12個(gè)玉米須β-谷甾醇提取液各2 mL于試管中，沿試管壁緩慢滴加1 mL濃硫酸，慢慢豎起試管，觀察液面交界處顏色。

1.4.2 HPLC法鑒定玉米須β-谷甾醇

1.4.2.1 對(duì)照液配制

精密稱(chēng)取β-谷甾醇對(duì)照品2.3 mg，置10 mL容量瓶，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾即得。

1.4.2.2 提取液的制備

取上述最優(yōu)提取條件下提取液100 mL，蒸干有機(jī)溶劑，加色譜級(jí)甲醇，定容至10 mL，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，即得。

1.4.2.3 色譜條件

試驗(yàn)采用C18反相色譜柱，流動(dòng)相為色譜級(jí)甲醇（進(jìn)行等度洗脫），流速為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫為26℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米須β-谷甾醇最大吸收波長(zhǎng)的檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在200 nm～400 nm紫外光區(qū)，每隔10 nm測(cè)定β-谷甾醇含量，得到掃描圖如圖1所示，其最大吸收波長(zhǎng)為243 nm，在243 nm處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)β-谷甾醇吸光度，即可得到β-谷甾醇濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，其回歸方程為y=0.5378x-0.0017，R2=0.9934，可知標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好。

圖1 β-谷甾醇提取液掃描圖Fig.1 The scanogram of β-sitosterol extraction

2.2 混合因素提取β-谷甾醇試驗(yàn)方案的建立

對(duì)玉米須β-谷甾醇的微波提取時(shí)間和乙醇濃度分別進(jìn)行了12水平的設(shè)計(jì)，對(duì)提取溫度、液固比和提取功率分別進(jìn)行了6水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)微波提取次數(shù)進(jìn)行了三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得混合因素的均勻設(shè)計(jì)方案如表3所示。

用回歸模型矩陣式方法，采用Matlab軟件可得各因素的相關(guān)系數(shù)及F回，處理數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

圖2 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of β-sitosterol

表3 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The uniformity experiment and result

表4 方差分析表Table 4 The analysis of variance

由表4數(shù)據(jù)可知，該試驗(yàn)的回歸方程為Y=0.19406-0.00082X1+0.06432X2-0.00042X3-0.00001X4+0.00075X5+0.00001X6，通過(guò)方程系數(shù)可知，微波提取試用驗(yàn)中提取次數(shù)和提取功率不顯著，其中提取溫度和時(shí)間與微波提取的β-谷甾醇的含量成反比，乙醇濃度和液固比與β-谷甾醇的含量成正比，回歸方程在0.05水平顯著，通過(guò)軟件處理可知回歸方程Y最大值為0.26397，將最大Y值帶入所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.5378x-0.0017中，可以計(jì)算出玉米須中β-谷甾醇含量為0.24%，提取的最佳工藝為微波提取時(shí)間為5 min，乙醇濃度為95%，提取溫度為20℃，液固比為30:1(mL/g)。

2.3 β-谷甾醇定性檢驗(yàn)

2.3.1 顯色劑定性測(cè)定

文中采用在玉米須提取液中滴加濃硫酸的顯色方法，對(duì)β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品和β-谷甾醇提取物進(jìn)行了顯色反應(yīng)，以便確定玉米須提取液中β-谷甾醇的存在，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)，在試管中液面交界處有玫瑰紅色生成，且靜置一段時(shí)間后下層有黃綠色液體變?yōu)榧t褐色。各提取液中加濃硫酸顯色情況統(tǒng)計(jì)如表5所示。

表5 定性檢測(cè)統(tǒng)計(jì)表Table 5 The statistical table of determine the nature

2.3.2 液相色譜定性測(cè)定

液相色譜定性測(cè)定見(jiàn)圖4。

圖4 β-谷甾醇對(duì)照品和提取液的高效液相色譜圖Fig.4 The HPLC of the standard and the extraction

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖可發(fā)現(xiàn)，在5 min以前出現(xiàn)了3個(gè)溶劑峰，在6.3 min和9 min左右出現(xiàn)β-谷甾醇對(duì)照品的色譜峰，同樣的色譜條件下檢測(cè)樣品提取液，在6.3 min和9 min左右也出現(xiàn)了2個(gè)色譜峰，由此可知，提取液中含有β-谷甾醇，其中2個(gè)物質(zhì)峰可能表明β-谷甾醇存在同分異構(gòu)體。

3 結(jié)果與討論

試驗(yàn)采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，可得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.5378x-0.0017，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9934，采用高效液相色譜法和顯色劑定性測(cè)定法，可知提取液中含有β-谷甾醇。

考慮到乙醇具有毒性低，生產(chǎn)安全性好，價(jià)格便宜的特點(diǎn)，且易于工業(yè)化及回收，所以采用乙醇作為本試驗(yàn)的提取溶劑。采用Matlab軟件分析微波法提取玉米須β-谷甾醇含量可知，β-谷甾醇的提取量隨微波提取時(shí)間的增大而減小，隨著提取時(shí)間的增加含量降低，隨微波提取溫度的增大而減小，原因可能是在微波輻射過(guò)程中，電磁波把能量直接傳播到原料內(nèi)部，使之瞬時(shí)加熱，當(dāng)提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生過(guò)高溫度，使β-谷甾醇活性成分濕熱降解或異構(gòu)化，導(dǎo)致提取物有效成分含量降低。在微波加熱過(guò)程中隨著溫度的升高，β-谷甾醇的活性成分被破壞，導(dǎo)致提取率的降低。但Matlab軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí)只能逼近顯著性因素的最優(yōu)區(qū)域，微波法提取玉米須β-谷甾醇的最優(yōu)工藝仍需在此基礎(chǔ)上進(jìn)行多元線性回歸設(shè)計(jì)，以求得最優(yōu)提取工藝參數(shù)。

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Extracting the β-Sitosterol from Maydis Stigma by Mix-Factor Uniformity Design

ZHAO Wen-zhu,YU Zhi-peng,YU Yi-ding,HE Shuai,LIU Jing-bo*
（Laboratory of Nutrition and Functional Food,College of Quartermaster Technology,Jilin University,Changchun 130062,Jilin,China）

To establish the method of β-sitosterol extracted by microwave.The β-sitosterol of the Stigma Maydis was extracted by mix-factor uniformity design,and the relationships of the alcohol concentration,extract time,extract power,the rat of dosage liquor,extract temperature and extract frequency with the β-sitosterol content were analyzed.The coefficient correlation of the exact power and exact progression may ignore due to little.The best extract technology is the 5 min,95%of the alcohol concentration,the ratio of solid to liquid was 30:1（mL/g）,and the extracting ratio of β-sitosterol was 0.24%.

uv detection;β-sitosterol;stigma maydis;microwave extraction;uniformity design

吉林省科技廳農(nóng)業(yè)重點(diǎn)項(xiàng)目（20080224）

趙文竹（1986—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與功能食品。

*通信作者：劉靜波（1962—），女(漢)，教授，博士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與功能食品。

2009-10-13