真空包裝煙熏火腿切片主要腐敗菌的分離及分子快速鑒定

胡萍，徐幸蓮，周光宏，李虹敏，謝偉，徐舶

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095；3.北華大學(xué)，吉林吉林132011）

真空包裝煙熏火腿切片主要腐敗菌的分離及分子快速鑒定

胡萍1，2，徐幸蓮2，周光宏2，李虹敏2，謝偉2，徐舶3

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095；3.北華大學(xué)，吉林吉林132011）

利用微生物分離純化與16S rDNA分子鑒定方法相結(jié)合，對(duì)真空包裝煙熏火腿切片貯藏過程中主要腐敗微生物菌相進(jìn)行分離鑒定。產(chǎn)品在4℃貯藏，于不同時(shí)間取樣，對(duì)其中微生物菌落進(jìn)行分離和純化、形態(tài)觀察和部分生理生化鑒定，對(duì)最終得到的細(xì)菌純培養(yǎng)物直接提取DNA，進(jìn)行16S rDNA V3可變區(qū)擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后于NCBI與已知序列進(jìn)行相似性比對(duì)。結(jié)果表明：從PCA和MRS培養(yǎng)基上共挑選出107株純菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，最后得到17株具有典型特征的純菌株，經(jīng)16S rDNA分子鑒定歸納為：Leuconostoc mesenteroides spp.、Lactobacillus sakei subsp.Sakei、Lactobacillus curvatus subsp.Melibiosus、Weissella viridescens、Dietzia sp.和 Plantibacter aurantiacus.等6個(gè)屬/種的細(xì)菌。

火腿切片；腐敗菌；分離；鑒定

Abstract:In this research,traditional microbiological method combination of molecular technology based on 16S rDNA were used to isolate and identify the predominate spoilage bacteria on vacuum packed sliced smoked cooked ham during storage period.The products were sampled at different time during storaged at 4℃,the microbial flor were isolated and classified by morphological and biochemical tests,than the final pure culture of bacteria DNA were directly exteracted and subjected to PCR to amplify the V3 region of the 16S rDNA,follow by sequencing which were aligned to 16S rDNA gene fragments available from NCBI to find the closest known relatives to this partial 16S rDNA sequences.The results showed that:there were 107 pure strains isolated from PCA and MRS medium which were classified as 17 strains with typical characteristics by morphologyical and biochemical identification.The predominate bacteria was summarized as six genus/species microorganisms.There are Leuconostoc mesenteroides spp.，Lactobacillus sakei subsp.Sakei，Lactobacillus curvatus subsp.Melibiosus，Weissella viridescens，Dietzia sp.and Plantibacter aurantiacus.

Key words：sliced cooked ham;spoilage bacteria;isolation;identification

煙熏火腿（smoked cooked ham），是典型的西式低溫肉制品。通常采用切片后真空包裝，2℃～8℃冷藏，保持了肉品原有的營(yíng)養(yǎng)，具有良好的感官，鮮嫩的口感和較高的出品率[1]。但是，低溫肉制品常存在產(chǎn)品出水、出油、褪色快、貨架期短等問題。肉制品貨架期的長(zhǎng)短依賴于所污染微生物的數(shù)量和類型，特別是初始菌群和貯存過程中最終生長(zhǎng)的菌群[2]。由于低溫肉制品的熱處理溫度為72℃左右，大多數(shù)微生物被殺死，在貯藏期間，某些特定的微生物適應(yīng)新的環(huán)境因素而存活下來，最終導(dǎo)致腐敗。研究發(fā)現(xiàn)，肉和肉制品初始菌落數(shù)量一般為102cfu/g～103cfu/g，但包含豐富的種群多樣性。了解肉制品中污染微生物的多樣性，確定主導(dǎo)腐敗微生物，最終揭示特定腐敗菌（specific spoilage organisms，SSO）及其致腐機(jī)理利于控制微生物的生長(zhǎng)繁殖以及采用正確的保鮮措施確保產(chǎn)品的安全性[3]。然而，運(yùn)用傳統(tǒng)微生物研究方法確切地了解肉制品的腐敗微生物還存在很多困難，因?yàn)槲⑸锓N和屬之間的顯性特征往往會(huì)因?yàn)榄h(huán)境差異而出現(xiàn)交叉表象[4]，傳統(tǒng)的分離鑒定方法存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而結(jié)果準(zhǔn)確性又受諸多因素影響的缺點(diǎn)。因此，本研究利用微生物分離純化與16S rDNA分子鑒定方法相結(jié)合，對(duì)真空包裝煙熏火腿切片貯藏過程中主要腐敗微生物菌相進(jìn)行分離與快速鑒定。能夠克服以往的難題，很好地揭示低溫肉制品中主導(dǎo)腐敗微生物菌相，目前相關(guān)的研究報(bào)導(dǎo)很少。本研究的結(jié)果可以為揭示低溫肉制品中的特定腐敗菌及其致腐機(jī)理打下良好的基礎(chǔ)，也為開發(fā)食品微生物的快速鑒定方法提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品制備

煙熏豬肉火腿切片在江蘇某食品公司生產(chǎn)，除未添加保鮮劑外，其余原輔料與該公司同類產(chǎn)品一致。主要有：豬肉、氯化鈉、聚磷酸鈉、谷氨酸鈉、白砂糖、植物蛋白、淀粉、香料、亞硝酸鹽以及水。真空包裝材料為PAPE。

生產(chǎn)工藝流程：原材料混合，4℃條件真空滾揉16h，灌裝入人工腸衣中，水煮至中心溫度達(dá)72℃，煙熏4 h，溫度為65℃～72℃，然后用流動(dòng)冷卻水迅速降溫0.5 h，置于4℃冷庫中冷卻過夜，第2天于低溫?zé)o菌分裝車間切片，厚度為0.5 cm，真空包裝。

1.1.2 取樣及處理

共取樣品100袋（100 g/袋）置于4℃閉光貯藏，于0、3、7、15、25、35 d 取樣（2 個(gè)重復(fù)），用于進(jìn)行微生物的分離培養(yǎng)。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

1）主要培養(yǎng)基

PCA（PlateCountAgar）平板計(jì)數(shù)瓊脂、NB（Nutrition Broth）營(yíng)養(yǎng)肉湯：路橋，北京；MRS（deManRogosaSharpe agar）瓊脂、MRB（deManRogosaSharpeBroth）肉湯：Oxoid,英國。

2）主要試劑

DNA Tissue Kit：QIAGEN,德國；Wizard SV Gel and PCR Clean-up System：Promega,美國；革蘭氏染色液（自配）；TE緩沖液（自配：10 mmol/L tris-HCL,1 mmol/L EDTA,pH 8.0）。去離子水：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.4 儀器及設(shè)備

HI9025c Microprocessor pH計(jì)：葡萄牙，Hanna；PCR 儀 Mastercycler ep personal： 德 國 ，Eppendorf；Powerpac Basic 164-5050水平電泳儀、凝膠成像儀GelDoc 2000 system：美國，BioRad；DP12顯微鏡數(shù)碼相機(jī)、PLYMPUS BX41系統(tǒng)顯微鏡：日本，OLYMPUS；Allegra64R高速冷凍離心機(jī)：美國，Beckman；2-6小型離心機(jī)：德國，Sigma；SW－CF－1F 超凈工作臺(tái)：中國，蘇凈；FA2004N電子天平：上海，丞明；BCD-192DC控溫冰箱：中國，Haier；HZQ-F160（A）高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱：江蘇，宏凱；微量進(jìn)樣器（1-10 μL、10-20 μL、20-200μL、100-1000μL）：德國，ENPERNDORF；其它微生物實(shí)驗(yàn)常用試管、移液管、量筒、三角瓶等玻璃器皿及接種針、接種環(huán)等。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離、純化和部分鑒定

無菌操作取25 g樣品（2個(gè)重復(fù)）加入225 mL生理鹽水（0.1%蛋白胨，0.9%NaCl）搖床振搖30 min。取1 mL上清液依次進(jìn)行10倍遞增稀釋，選3個(gè)合適的稀釋度，每個(gè)稀釋度做2個(gè)重復(fù)，傾注平板。采用PCA和MRS培養(yǎng)基分別于37℃和30℃下培養(yǎng)48 h[5]。

每一次取樣時(shí)間在PCA和MRS培養(yǎng)基上進(jìn)行的培養(yǎng)，選擇適當(dāng)稀釋濃度（菌落在30～300之間）的平皿，在其培養(yǎng)基上挑選典型的單一菌落，平板劃線法反復(fù)進(jìn)行分離、純化（>3次），得到純菌，然后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，細(xì)胞染色和細(xì)胞形態(tài)觀察。

1.2.1.1 分離和純化

從上述培養(yǎng)基平板上挑取典型生長(zhǎng)的菌落，在相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，得到純化的單菌落。

1.2.1.2 菌落特征與細(xì)菌形態(tài)特征觀察

觀察并記錄已分離純化的單個(gè)菌落的形態(tài)，包括大小、形態(tài)、隆起程度、邊緣結(jié)構(gòu)、表面形態(tài)、光澤度、透明度、質(zhì)地及顏色等。

挑取培養(yǎng)18 h~24 h長(zhǎng)勢(shì)好的單一菌落，通過革蘭氏染色觀察菌株個(gè)體形態(tài)，包括細(xì)胞的形狀、細(xì)胞間的排列方式等。

1.2.1.3 氧化酶試驗(yàn)

參考東秀珠等方法[6]，用細(xì)玻棒挑取18 h～24 h菌齡的菌苔，涂抹在濕濾紙20 s反應(yīng)，無氣泡者為陰性。

1.2.1.4 觸酶試驗(yàn)

以滅菌牙簽挑取少量培養(yǎng)18 h～24 h的菌苔，涂抹于已滴有3%過氧化氫的玻片上，如有氣泡產(chǎn)生則為陽性，無氣泡為陰性。

1.2.1.5 分類保存

根據(jù)菌落特征和形態(tài)學(xué)特征，首先將挑選出來的菌株進(jìn)行分組歸類，再將各組菌株進(jìn)行純培養(yǎng)，重復(fù)以上比較，將菌落特征和形態(tài)學(xué)特征有差異的重新分類，再經(jīng)過純培養(yǎng)，重復(fù)以上操作3次，最后將純菌株接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）和MRS肉湯中分別在37℃和30℃條件下培養(yǎng)24 h，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌培養(yǎng)液取10 mL，4℃，10000×g離心 15 min，棄上清，將細(xì)菌于-20℃保存，用于下一步提取DNA[7]。

1.2.2 純培養(yǎng)細(xì)菌DNA的提取

將上述純細(xì)菌取出（2個(gè)重復(fù)），添加10 mL滅菌去離子水，充分振蕩混均。取1 mL混合液于1.5 mL離心管，4℃、14000×g離心10 min。棄上清，將沉淀用100 μL TE緩沖液溶解混均，參照DNA Tissue Kit(QIAGEN,Germany)說明，用該試劑盒提取總的細(xì)菌DNA。所提取DNA溶于TE緩沖液，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，-20℃條件貯藏。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[8]：gc338f:5′-CGCCCGCCGCG CGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3′,518r:5′-ATTACCGCGGCTGC TGG-3′，擴(kuò)增細(xì)菌 16S rDNA 的 V3 可變區(qū)序列[6，9]。25 μL 反應(yīng)體系包含：1 μL 模板 DNA,引物各2.5 μL（1 μmol/L）,GoTaq Green Master Mix(2 × )（Promega,USA)12.5 μL 以及雙蒸水 6.5 μL。采用“降落”PCR(touchdown PCR)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，退火溫度從65℃到55℃，每個(gè)循環(huán)降低0.5℃，退火時(shí)間為3 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。再于恒定退火溫度下進(jìn)行10個(gè)循環(huán)（94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min）。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳檢測(cè)后于-20℃冷凍備用。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)序及分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送上海生工公司測(cè)序。登錄NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，將所得序列與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行相似性比對(duì)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離、純化和初步鑒定

真空包裝煙熏豬肉火腿切片4℃貯藏過程中（0 d～45 d），從PCA和MRS培養(yǎng)基上具有典型特征的菌落上共挑選出107株純菌株。經(jīng)反復(fù)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和比較，最后得到17株在菌落型態(tài)、細(xì)菌形態(tài)、生化特性上有差異的純菌株。分離菌株的菌落特征、細(xì)菌形態(tài)特征和部分生理生化特性的觀察結(jié)果和試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 分離菌株的菌落特征、形態(tài)特征和部分生理生化特性Table 1 Characteristics of community,morphology and part of physiology of isolation strains

2.2 細(xì)菌16S rDNA的V3可變區(qū)PCR結(jié)果

以分離純化的17株細(xì)菌DNA為模版，用16S rDNA的V3可變區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得230 bp左右的特異性擴(kuò)增片斷，如圖1所示。

圖1 分離純菌株細(xì)菌16S rDNA的V3可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.1 Agaros electrophoresis photo of PCR amplification products of 16S rDNA V3 regions of 17 bacterium colonies

從圖1可見，所有樣品都有較亮的擴(kuò)增條帶，片段約230 bp左右，說明本試驗(yàn)的PCR擴(kuò)增條件是比較合適的，適合用于測(cè)序分析。

表2 17株細(xì)菌的16S rDNA V3可變區(qū)序列Table 2 16S rDNA V3 region sequenc of 17 strains

2.3 序列分析及鑒定

序列進(jìn)行測(cè)序，17株細(xì)菌16S rDNA V3可變區(qū)序列如表2所示。登陸NCBI與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中已知序列比對(duì)，以最大相似率來確認(rèn)，最后得到代表6個(gè)不同屬或種的17株菌株，如表3所示。菌株1，4，5，6，11，16 代 表 腸 膜 明 串 珠 菌 種 的 細(xì) 菌（Leuconostoc mesenteroides spp.），其中6和11為腸膜明串株菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides）；菌株 2，7，8，9，10，15 代表清酒乳桿菌清酒亞種的細(xì)菌（Lactobacillus sakei subsp.sakei）；菌株3為清酒乳桿菌肉食亞種（Lactobacillus sakei subsp.carnosus）；菌株 14為彎曲乳桿菌蜜二糖亞種（Lactobacillus curvatus subsp.melibiosus）；17菌株代表綠色魏氏菌（Weissella viridescens）；菌株 12，13分別代表細(xì)菌Dietzia sp.和Plantibacter aurantiacus。

表3 通過16S rDNA序列鑒定切片火腿上分離出的純菌株Table 3 Strains identified by means of 16S rDNA sequencing fragments from pure culture isolated from sliced cooked ham

3 討論與結(jié)論

大量研究表明，乳酸菌是各種類型的肉及肉制品中的主要腐敗菌[10-12]。本研究中所分離的17株菌中有14株菌是乳酸菌，因此可以推斷真空包裝煙熏火腿切片的主導(dǎo)腐敗菌群也是乳酸菌。有研究報(bào)導(dǎo)真空包裝低溫肉制品產(chǎn)黏是由于同型發(fā)酵的乳酸桿菌（Lactobacillus spp.） 以及異型發(fā)酵的明串珠菌（Leuconostoc spp.）導(dǎo)致的[13-14]。有報(bào)導(dǎo)稱清酒乳桿菌的某些能產(chǎn)生黏液的菌株具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)力[15]。還有研究發(fā)現(xiàn)，清酒乳桿菌/彎曲乳桿菌（Lactobacillus sakei/curvatus）是很多發(fā)酵食品酸化后期的主要菌群，在發(fā)酵中起著重要的作用；Lactobacillus sakei/curvatus是煙熏蒸煮類低溫肉制品中的主要菌群，這兩種菌在低溫肉制品中具有很好的共存特征[15-16]。在本研究中亦分離出了：腸膜明串珠菌、清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌。這為進(jìn)一步利用分子指紋圖譜技術(shù)證實(shí)真空包裝煙熏火腿切片的主導(dǎo)腐敗菌群打下了很好的基礎(chǔ)[17]。

由結(jié)果可知真空包裝煙熏火腿切片的腐敗微生物存在較高的多樣性。除了腸膜明串珠菌、清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌等乳酸菌外，還有綠色魏氏菌等污水常見腐敗菌，而Dietzia sp.和Plantibacter aurantiacus.屬于嗜冷菌，可能是原料肉在冷藏過程中污染的。可見，肉制品上乳酸菌的多樣性反映了加工環(huán)境污染的差異性，說明該產(chǎn)品的微生物污染具有一定的復(fù)雜性，其中原料肉也被認(rèn)為是一個(gè)重要的污染源。

快速、準(zhǔn)確地確定那些強(qiáng)烈影響低溫肉制品最終品質(zhì)和衛(wèi)生安全的腐敗微生物，有助選擇正確的加工工藝和采取有效的保鮮方法。本研究利用微生物分離純化與16S rDNA分子鑒定方法相結(jié)合，對(duì)真空包裝煙熏火腿切片主要腐敗微生物菌相進(jìn)行分離鑒定，最終 分 離 鑒 定 出 ：Leuconostoc mesenteroides spp.、Lactobacillus sakei subsp.Sakei、Lactobacillus curvatus subsp.Melibiosus、Weissella viridescens、Dietzia sp. 和Plantibacter aurantiacus.等6個(gè)屬/種的菌株。

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Isolation and Rapid Identification of Molecular of the Predominate Spoilage Bacteria on Sliced Vacuum Packed Cooked Ham

HU Ping1,2,XU Xing-lian2,ZHOU Guang-hong2,LI Hong-min2,XIE Wei2,XU Bo3
（1.College of Life Science，Guizhou University，Guiyang 550025，Guizhou，China；2.Key Lab of Meat Processing and Quality Control，Ministry of Education，College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，Jiangsu，China；3.BeiHua University，Jilin 132011，Jilin，China）

2010-05-31

國家科技支撐計(jì)劃(2006 BAD05A15)；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合NY字[2009]3076）

胡萍（1970—），女（漢），副教授，博士，研究方向：食品安全與生物技術(shù)。