不同家系馬尾松插穗內源生根抑制物的分離、純化及鑒定

李永進，丁貴杰

（1.貴州大學 造林生態研究所，貴州 貴陽 550025；2.湖南省林業科學院，湖南 長沙 410004）

馬尾松Pinus massoniana是中國特有的最重要的鄉土工業用材林樹種之一，在森林資源發展中，具有十分重要的地位。它具有分布廣，適應性強，耐干旱貧瘠，速生豐產，用途廣泛，纖維優良和全樹綜合利用程度高等特點［1］。20世紀90年代以來，一些學者對馬尾松扦插繁殖技術進行了研究［2－6］，取得了較大突破，對馬尾松內源抑制物也有一些研究報道［7－8］，但未見有從家系水平探討馬尾松內源抑制物的文獻報道。筆者借鑒國內有關內源抑制物的研究經驗［9－11］，選取5個家系馬尾松插穗進行內源抑制物的測定分析，希冀通過對其內源抑制物質的分析來揭示不同家系馬尾松插穗難生根的原因，為提高馬尾松插穗生根率，推動無性繁殖及改良工作提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 插穗的來源

插穗采自重慶亞克公司馬尾松采穗圃。以2年生的5個家系（Z364，Z505，Z190，Z258，Z235）作為采穗母株，選取當年生半木質化，生長健壯，10 cm左右的萌條作為穗條。

1.2 內源抑制物質的提取和純化

材料的處理方法見參考文獻［7］，并按圖1所示流程對內源抑制物質進行分離、純化，制備得到5個家系插穗內源抑制物質提取液。

1.3 提取分離物的活性測定

先把提取得到的Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ等4種乙醚提取物，分別濃縮定容至100 mL。在培養皿中放入濾紙，分別加入Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ等4種乙醚提取物1.0 mL，待乙醚完全揮發后，加入蒸餾水10 mL·皿－1，用白菜Brassica chinensis種子進行活性鑒定，蒸餾水做對照。在培養箱內，28℃條件下黑暗中培養24 h。24 h后測定白菜種子發芽率，48 h后測定幼根長度。試驗重復3次。

1.4 紙層析、化學鑒定及生物鑒定

內源抑制物成分的紙層析、化學鑒定及以白菜為材料進行生物鑒定的方法均見參考文獻［7］。另外，進行紙層析時，同時用內源抑制物提取液進行脫落酸標準品的紙層析，用正丁醇 ∶乙酸乙酯 ∶乙醇（4∶5∶1）為溶劑，對脫落酸標準品和提取物Ⅲ進行紙層析。

1.5 儀器分析

高效液相色譜儀（Agilent 1100，美國Agilent公司）分析條件為490紫外檢測器，Zorbax Eclipse XDBC18 柱（4.6 mm × 150.0 mm；5 μm），流動相為 15.0 g·kg－1醋酸 ∶甲醇＝30 ∶70，流速為 1.0 mL·min－1，壓力為2 000 Pa，柱溫為 25℃，檢測波長為 260 nm，靈敏度0.2，進樣量均為10 μL·次－1。

各類插穗內源抑制物經高效液相色譜法（HPLC）分離提純，得單一吸收峰的組分，從各組分中吸取10 μL，使各對應組分混和檢查是否仍為單一吸收峰。

用紫外/可見光光度計（UT-1800，中國北京普析通用儀器有限責任公司）檢測分離物各組分200～300 nm波長范圍的紫外光譜圖。

1.6 扦插試驗

取上述5個家系插穗各40個，按隨機區組設計，50個插穗·小區－1，共4個重復，按4 cm×5 cm的密度扦插；3個月后調查其生根率。

1.7 數據處理

采用高效液相色譜法（HPLC）自動積分儀法，得內源抑制物每個吸收峰面積。

圖1 馬尾松插穗內源抑制物質的分離純化流程Figure 1 Isolation and purification flow of endogenous inhibitor contents in Pinus massoniana cuttings

2 結果與分析

2.1 4種乙醚提取分離物質的活性比較

從表1可以看出，5個家系插穗中存在著活性較高的內源抑制物。提取物Ⅰ，提取物Ⅱ，提取物Ⅲ，提取物Ⅳ等4種乙醚提取物的抑制活性差別較大，提取物Ⅲ和提取物Ⅳ的抑制活性最強，兩者對白菜幼根生長的抑制活性明顯高于對白菜種子萌發的抑制活性，且提取物Ⅳ對白菜種子萌發的抑制活性最強，用其處理的白菜種子發芽率僅為對照的14%。提取物Ⅰ和提取物Ⅱ對白菜種子萌發、幼根生長抑制作用較小。

表1 乙醚提取分離物的抑制活性Table 1 Inhibiting activity of the outlier adjusted with ether

2.2 內源抑制物提取液的紙層析與成分鑒定

內源抑制物提取液在以異丙醇 ∶氨水 ∶水（8∶1∶1）為溶劑進行紙層析后，發現內源抑制物提取液在濾紙上的移動速度（Rf）存在差異。經10.0 g·kg－1三氯化鐵乙醇溶液鑒定，發現在Rf＝0～0.50區段有3個分離不明顯的棕褐色斑點，說明抑制物內含有苯酚類。經10.0 g·kg－1三氯化鋁乙醇溶液鑒定，發現在Rf＝0～0.35區段有2個分離不明顯的弱熒光斑，在Rf＝0.35～0.50區段有一個強熒光斑，表明其中有黃酮類。同時發現在紫外光下分離物層析紙上Rf＝0.70處和脫落酸標準品Rf＝0.70處，都有熒光出現，只是脫落酸標準品的熒光斑大；另外，脫落酸標準品和提取物Ⅲ在以環己烷 ∶乙酸乙酯（7∶3）為溶劑紙層析后，發現兩者的Rf值同為0.60，由此推斷分離物中可能含有脫落酸類物質。

結果還發現，各種插穗的內源抑制物斑點位置相同，但斑點顏色的深淺有差異，表明各家系插穗的內源抑制物種類相同但含量存在差異。另外，乙醚萃取殘余液紙層析分離后，進行生物鑒定表明，萃取殘余液中的有些成分對白菜種子的萌發和幼根的生長也有抑制作用。由此推測，馬尾松插穗中可能存在著兩大類內源抑制物質：一類水溶性較強，另一類則易溶于乙醚等非極性溶劑。

2.3 內源抑制物的HPLC分離與鑒定

2.3.1 分離提純和初步定性 內源抑制物經HPLC分離，均產生7個吸收峰（圖2）。這與紙層析每組分均產生7個斑點相吻合，進一步確證內源抑制物由 7種成分（MI1，MI2，MI3，MI4，MI5，MI6和 MI7）組成。將各類插穗的內源抑制物各對應組分混合，即MI1與MI1相混合，MI2與MI2相混合，……，各混合液經HPLC分離，發現混合物仍為單一吸收峰，進一步確證各家系馬尾松插穗的內源抑制物組分完全相同，不同之處僅在于濃度上的差異。由此可以推測，內源抑制物的表達受遺傳基因控制，環境因子影響其表達程度［9］。在確證各類插穗內源抑制物相同的前提下，僅須檢測其中一個家系內源抑制物的紫外光譜圖。結果發現 MI1，MI2，MI3，MI4，MI5，MI6和 MI7分別在 228，215，253，262，274，286和234 nm有最大吸收峰。據內源抑制物 7組分的紙層析Rf值及苯酚類和黃酮類的紫外吸收峰波長，進一步確證了MI1，MI2和MI7為苯酚類，MI3，MI5和MI6為黃酮類，而MI4為脫落酸類。

2.3.2 內源抑制物組分相對含量比較 由圖2可以看出，5種家系插穗的內源抑制物對應組分吸收峰的高度存在著差異。根據HPLC自動積分儀所得峰面積，計算各對應組分相對含量相對比較值（表2）。從表2中可以看出，5個家系的內源抑制物各組分總相對含量，以Z364為最高，Z235為最低；不同家系間，插穗內源抑制物各組分相對含量差異較大，其中以MI4相差最懸殊，Z364插穗的MI4相對含量值為最高，達57.79%，而Z505插穗的MI4相對含量較低，僅為7.79%。對內源抑制物各組分在5個家系間的含量進行方差分析表明，內源抑制物各組分在5個家系插穗中的相對含量存在顯著差異（P=0.032 9＜0.05）。

圖2 不同家系母株插穗內源抑制物的HPLC圖譜Figure 2 HPLC figures of endogenous inhibitor in cuttings from five Pinus massoniana lines

表2 不同家系馬尾松母株插穗內源抑制物質對應組分相對含量比較Table 2 Comparison of the relative content of endogenous inhibitor in cuttings from five Pinus massoniana lines

2.3.3 內源抑制物的生物鑒定 用白菜種子萌發和幼根的生長對內源抑制物提取液進行生物鑒定。結果表明（表3）：MI3，MI4，MI6，MI5，MI7共5種組分的抑制程度較大，其中MI6和MI7抑制程度最大，而Z364各個組分整體抑制程度都大于其他家系，說明內源抑制物在一定程度上抑制了白菜種子的萌發和幼根的生長。對5個家系插穗內的內源抑制物各組分對白菜幼根生長的影響進行方差分析表明，內源抑制物各組分對白菜幼根生長的影響存在極顯著差異（P=0.000 1＜0.01），而在5個家系之間，插穗內內源抑制物的同一組分對白菜幼根生長的影響無顯著性差異（P=0.088 1＞0.05）。

2.3.4 扦插成活率的驗證 據5個馬尾松插穗扦插生根率調查結果發現，在5個馬尾松家系之間，其扦插生根率存在較大差異，5個家系的生根率分別為49.5%，74.5%，70.0%，53.0%和84.5%；對其生根率與內源抑制物各組分相對含量進行相關性分析表明（表4），馬尾松扦插成活率與MI2和MI3呈極顯著負相關，與內源抑制物總量、MI1呈顯著負相關，與MI4，MI5和MI7存在負相關，與MI6存在正相關，但相關性并不明顯。因此，阻遏內源抑制物基因表達或采取其他措施降低內源抑制物含量，將是提高馬尾松扦插成活率的一個關鍵措施。

表3 內源抑制物各組分對白菜幼根生長的影響Table 3 Influence of endogenous inhibitor in cutting on the Brassica chinensis radical

表4 5個家系插穗生根率與內源抑制物各組分相對含量間的相關性分析Table 4 Correlation between the relative content of endogenous inhibitor and the rooting rate of 5 Pinus massoniana lines

3 結論

馬尾松插穗生根率低的內部因素之一是插穗中存在活性較高的7種內源抑制物質，它們為黃酮類、苯酚類和脫落酸類物質；MI1，MI2和MI7為苯酚類，MI3，MI5和MI6為黃酮類，而MI4為脫落酸類。季孔庶等［7－8］研究發現，內源抑制物屬黃酮類和苯酚類，而沒發現脫落酸類，筆者再次進行本研究的重復實驗，仍檢測出脫落酸類的存在，這種差異可能由于提取路線、采穗季節的不同造成的，這方面原因需要進一步探討。

5個家系插穗內源抑制物質對應組分的相同性，表明其插穗內源抑制物質受遺傳基因的控制。內源抑制物各組分在5個家系插穗內的相對含量存在顯著差異，且內源抑制物各組分對白菜幼根生長的抑制程度存在極顯著差異；在5個家系之間，插穗內內源抑制物的同一組分對白菜幼根生長的抑制程度無顯著差異。對內源抑制物對各組分相對含量與生根率之間的相關性分析可知，除MI6外，馬尾松插穗內的內源抑制物各組分與扦插生根率均呈負相關。另外，對分離物和乙醚萃取殘余液進行生物鑒定表明，內源抑制物質大致可分為2類：一類易溶于水的，另一類易溶于乙醚等非極性溶劑。

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