南方紅豆杉離體胚培養誘導不定芽研究

曾余力，林新春，桂仁意，張翠萍，黃麗春

（浙江農林大學 浙江省現代森林培育重點實驗室，浙江 臨安 311300）

南方紅豆杉Taxus chinensis var.mairei屬國家一級瀕危保護植物之一，集材用、藥用、觀賞于一體，經濟價值極高。由于紅豆杉屬Taxus植物本身特殊的生物學特性，種子在天然條件下，需要兩冬一夏才能萌發并且植株生長緩慢［1］，常規育種難以保證市場的需要，故通過離體胚培養技術克服紅豆杉種子難以萌發的缺點，以期加快植株生長。近年來，國內外學者對短葉紅豆杉Taxus brevifolia，歐洲紅豆杉Taxus baccata，雜種紅豆杉Taxus×media var.hicksii，東北紅豆杉Taxus cuspidata等進行了離體胚培養研究［2－3］，從不同角度證實離體胚的萌發、成苗與培養基、種子來源、培養條件等有密切關系，但對南方紅豆杉離體胚培養的研究較少，僅見臧新等［4－5］對南方紅豆杉離體胚萌發影響因素的研究。本研究在前人的研究基礎上以南方紅豆杉的成熟胚為外植體，篩選外植體滅菌途徑，基本培養基、植物生長調節物質等因子對離體胚生長和分化不定芽的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料購自浙江省嵊州市常青花木場，于4℃冰箱中冷藏備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體滅菌 選取均勻飽滿的種子，剝去外種殼，流水沖洗12 h，置于超凈工作臺內，分別置于 5.0，10.0，25.0 g·L－1的次氯酸鈉（NaClO）溶液中真空滅菌 5，10，15 min，無菌水分別沖洗 5遍。最后在解剖顯微鏡下切除胚乳挑取種胚，接入MS（Murashige and Skoog）培養基中，1個種胚·管－1，各接種100管。接種后先暗培養2 d，然后再光培養。

1.2.2 不同基本培養基與植物生長調節物質對離體胚培養的影響 試驗一，挑取種胚分別接種于MS，1/2MS，1/3MS，1/4MS，WPM（woody plant medium）和 B5（Gamborg）等 6種基本培養基中，測試基本培養基的影響；試驗二，以WPM為基本培養基，測試不同種類和質量濃度的植物生長調節物質的影響：噻苯隆（TDZ）為 0，0.000 1，0.001 0，0.010 0，0.100 0 mg·L－1，細胞激動素（KT），6-芐氨基腺嘌呤（6-BA），異戊烯基腺嘌呤（2iP）和玉米素（ZT）為 0，0.030 0，0.300 0，1.000 0，3.000 0，10.000 0 mg·L－1。

1.2.3 種胚萌動對離體胚培養的影響 根據種胚大小、顏色分別選取萌動（長度為0.7～0.8 cm，顏色轉微黃色）和未萌動（長度為0.4～0.5 cm，顏色白色）的種胚，測試不同發育時期對胚培養的影響。以WPM為基本培養基，附加 0，0.010 0，0.100 0，1.000 0 mg·L－1的 6-BA。以上試驗培養條件：溫度為（25±2）℃，光照度為2 500～2 800 lx，光周期（晝/夜）16/8 h。對照組（ck）為WPM基本培養基。

1.2.4 馴化移栽 將帶根的試管苗置于馴化室中，在強光（2萬 lx）下練苗4周，然后取出試管苗，沖凈根部培養基，將植株移至泥炭 ∶珍珠巖 ∶蛭石為1∶1∶1的人工基質中。

1.3 統計分析

以上各試驗設計3個重復，各試驗的結果分析均采用生物統計法將平均值及其標準誤差［6］和95%的可信度進行差異顯著性分析［7］。

2 結果與分析

2.1 外植體滅菌

培養28 d后調查，結果見表1。最優滅菌處理為25.0 g·L－1次氯酸鈉溶液真空滅菌10 min，其污染率僅6%，出苗率達86%。試驗結果表明，隨次氯酸鈉質量濃度升高，污染率顯著降低，而滅菌時間加長也能有效降低污染。由于南方紅豆杉胚乳較厚，高質量濃度次氯酸鈉浸泡不會損傷到離體胚的萌發生長，各處理的萌發率為93%～98%。

2.2 不同基本培養基與植物生長調節劑對離體胚培養的影響

2.2.1 不同基本培養基對離體胚培養的影響 將南方紅豆杉離體種胚接于不同基本培養基中，培養2個月后，MS培養基中的胚，葉色淡綠，莖較長較粗，但根較短無側根，根長約2.0 cm。在不同MS質量濃度（1/3MS，1/2MS，MS）培養基的胚，隨無機鹽質量濃度升高，芽長增長；在1/3MS中根長最長，根數最多。可能是南方紅豆杉莖伸長生長需要高質量濃度的無機鹽離子，根生長則以低質量濃度無機鹽離子為宜，而莖葉和根的平衡生長則需要大量元素的協調配比。對應MS培養基，WPM培養基中離體胚莖段細長，葉色深綠，并有許多側根生成，根系好，主根長度達3.8 cm，平均根數達4.3條，是南方紅豆杉胚培養的最佳基本培養基；B5培養基由于莖細弱，葉色發黃，不適于南方紅豆杉的胚培養（圖1～3）。

2.2.2 不同植物生長調節物質對離體胚培養的影響 將離體種胚接種于含有不同質量濃度的6-BA的培養基中，50 d調查結果如表2。與對照組相比，6-BA質量濃度遞增時，離體胚抽出莖葉的長度遞降，胚根長度變短甚至不萌發，胚軸上有突起發生。在6-BA 0.03 mg·L－1時，胚軸有突起形成，少數有不定芽分化；質量濃度增加至0.10 mg·L－1，不定芽數量增加；但6-BA質量濃度增高到1.00 mg·L－1時，突起變少，且突起不能分化為不定芽，并隨之褐化。將離體種胚接種于含有不同質量濃度的KT

的培養基中，50 d調查結果如表3。由表3可知，0.10 mg·L－1KT的培養基中離體胚無莖葉抽出和胚根伸長，但可見叢生不定芽的分化，誘導率達30%。與6-BA相比，KT更優于不定芽的分化，但對莖葉和胚根生長的抑制較明顯；當KT質量濃度升高至0.30 mg·L－1時不定芽的誘導率降低，而且隨KT質量濃度的升高，對胚根發育的抑制越強；當質量濃度提高至10.00 mg·L－1時，離體胚無生長、褐化。試驗發現，接種于含6-BA的培養基中的離體胚僅在胚軸上有突起產生，分化少量不定芽，而接種于含KT培養基中的離體胚在胚軸、子葉和生長點均有不定芽的分化。將離體種胚接種于含不同濃度ZT的培養基中，50 d調查結果如表4。由表4可知，ZT也能有效誘導不定芽的分化。當ZT的質量濃度在0.10～1.00 mg·L－1時，胚軸、生長點和子葉均有不定芽分化，且多為叢生芽，當ZT質量濃度為1.00 mg·L－1時誘導率高達50%，與KT不同的是，ZT對莖葉抽出抑制不明顯，KT質量濃度為0.10 mg·L－1時無莖葉抽出，而ZT的質量濃度為1.00 mg·L－1時仍有莖葉抽出，但節間較短，并且有輕微水化現象；當ZT升至3.00 mg·L－1時，水化更為明顯。在含不同質量濃度2ip的培養基中，2iP對不定芽的誘導較6-BA強（表5），對南方紅豆杉離體胚不定芽的誘導率最高，質量濃度為0.30 mg·L－1時，誘導率高達70%，但僅有1～2個單芽·胚－1，而KT和ZT的不定芽多為叢芽。對莖葉抽出抑制效果低于6-BA，當質量濃度為3.00 mg·L－1莖葉仍有抽出，葉色較綠。添加TDZ的試驗處理，都無不定芽分化。低質量濃度TDZ中試管苗生長與對照組相似，質量濃度高于0.100 0 mg·L－1，胚軸膨脹，試管苗有水化現象；當質量濃度增加到1.000 0 mg·L－1，種胚呈黃褐色愈合組織（表6）。

表1 種子表面滅菌對離體種胚培養的影響Table 1 Effect of factorial tests among various concentrations of NaClO vs.its durations on germination of excised embryos

圖1 不同基本培養基對芽體生長的影響Figure 1 Effects of basal media on shoot growth of Taxus chinensis var.mairei

圖2 不同基本培養基對根數的影響Figure 2 Effects of basal media on root number of Taxus chinensis var.mairei

圖3 不同基本培養基對根長生長的影響Figure 3 Effect of basal media on root growth of Taxus chinensis var.mairei

表2 6-BA對種胚培養誘導不定芽分化的影響Table 2 Effect of 6-BA on induction of adventitious buds by embryo culture

表3 KT對種胚培養誘導不定芽分化的影響Table 3 Effect of KT on induction of adventitious buds by embryo culture

表4 ZT對種胚培養誘導不定芽分化的影響Table 4 Effect of ZT on induction of adventitious buds by embryo culture

2.3 種胚萌動對離體胚培養的影響

由表7可知，將萌動的種胚接種到含0.10～1.00 mg·L－16-BA的培養基上，離體胚分化出大量不定芽；而且隨6-BA質量濃度增高，胚軸分化不定芽的數量呈現先升高后下降的趨勢；但是將未萌動的種胚接種到相同的培養基中，僅在胚軸處產生突起，沒有不定芽的分化。

表5 2iP對種胚培養誘導不定芽分化的影響Table 5 Effect of 2iP on induction of adventitious buds by embryo culture

表6 TDZ對種胚培養誘導不定芽分化的影響Table 6 Effect of TDZ on induction of adventitious buds by embryo culture

表7 種胚萌動前后對胚培養的影響Table 7 Effect of with or without breaking seed dormancy on germination of excised embryos

2.4 馴化移栽

將試管苗置于模擬自然環境中，經1個月練苗馴化后，移至混合人工基質中，成活率達到90%。

3 結論與討論

木本植物組織培養的困難之一是建立無菌材料。在建立無菌材料時，外植體表面滅菌將影響試驗成敗。本研究采用25.0 g·L－1次氯酸鈉溶液真空滅菌10 min，污染率僅為6%，出苗率達86%。而且由于南方紅豆杉胚乳較厚，高質量濃度的次氯酸鈉溶液不會傷害到內部的胚，對其萌發無影響。試驗還發現南方紅豆杉種胚在MS培養基上能夠較好的萌發生長，萌發率在95%左右，而陳永勤等［8］曾報道紅豆杉在MS培養基上的萌發較差，這與本研究結果不一致。

臧新等［5］對MS和B5等培養基進行研究，認為這幾種培養基對南方紅豆杉的離體胚培養影響差別不大，而我們在研究中發現不同基本培養基對離體胚培養影響較大。WPM培養基能促進根系產生和莖葉生長，是南方紅豆杉離體種胚培養最適宜的基本培養基。MS培養基對南方紅豆杉莖段生長亦較佳，但不利其根系的生長。B5培養基也不適于南方紅豆杉的胚培養。

在不同細胞分裂素對離體種胚培養的影響試驗中發現，不加細胞分裂素時試管苗生長最好，添加細胞分裂素不利于種胚的伸長生長，但可誘導不定芽的產生且不需經過愈合組織而直接分化產生不定芽，其中KT和ZT最適于南方紅豆杉的不定芽誘導。對于大多數樹種，誘導不定芽時，外植體需接種在細胞分裂素與生長素配比的培養基中，但在許多針葉樹培養中，單獨使用細胞分裂素，足以誘導不定芽發生［9－10］，這與本試驗研究結果相一致。

萌動后的南方紅豆杉種子具有較強的生長勢和生理活性，而且此時內源激素含量高于其他時期，而未萌動的種子中發芽抑制物的含量較高［11］，抑制種子的萌發生長。南方紅豆杉種胚萌動對胚培養的影響，試驗得知以萌動后的種胚為外植體更容易誘導出不定芽，這可能與南方紅豆杉種胚內源激素隨種胚成熟度而發生變化有關。

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