腎活檢標(biāo)本的冰凍切片直接免疫熒光法中冰凍切片對包埋劑的選擇及應(yīng)用

林宇靜 王曉鴻 茍新敏 鄭燕璇 曹婉維

腎臟疾病中，變態(tài)反應(yīng)在其病因發(fā)病機(jī)制中占很大比重，所以在腎活檢標(biāo)本中顯示抗原或抗體是很重要的，一般使用冰凍切片直接免疫熒光法觀察切片標(biāo)本上熒光抗體染色結(jié)果作為抗原的鑒定和定位。冰凍切片直接免疫熒光法要求冰凍切片質(zhì)量優(yōu)良，制作一張質(zhì)量優(yōu)良的冰凍切片，制片過程中的每一步環(huán)節(jié)都很重要，其中包埋劑的使用也很關(guān)鍵，包埋劑包埋組織(-20℃ ～25℃)冷凍后對組織起到支托固定的作用。現(xiàn)工作中制作冰凍切片常用包埋劑是OCT，在多年臨床工作中，我科使用普通膠水替代OCT包埋，所制冰凍切片用于直接免疫熒光檢查與使用OCT包埋劑所制冰凍切片用于直接免疫熒光檢查效果相同。

1 材料與方法

1.1 材料 腎活檢標(biāo)本，普通膠水(把膠水裝入用完的OCT包埋劑的空瓶中)，冰凍托盤架置于(-20℃ ～25℃)冰凍切片機(jī)箱體中待用，載玻片、熒光抗體(兔抗人IgA、兔抗人IgG、兔抗人IgM、兔抗人C1q、兔抗人C3)抗體為丹麥DAKO公司產(chǎn)品，PBS，緩沖甘油等。

1.2 方法 將腎活檢組織取材后放置到待用的托盤架正中位置上(由于腎活檢組織小，托盤架要做底座，用膠水替代OCT做底座)，用膠水替代OCT將組織塊完全包埋。在-20℃～25℃溫度中托盤架上的組織被包埋劑包裹迅速凝凍固定。取下托盤架固定到冰凍機(jī)的冷凍頭上。(冷凍頭設(shè)定溫度為-15℃左右)開始修切冷凍頭上的組織至合適時留片，切片要求盡量薄些，以利抗原抗體接觸和鏡檢。取出切片用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干固定。PBS沖洗3次，3 min/次，甩去PBS加熒光抗體20 μl，置于37℃溫箱孵育18～30 min取出，PBS沖洗3次，3 min/次，甩去PBS，緩沖甘油封片避光。

2 結(jié)果

用膠水包埋的組織塊凝凍迅速，質(zhì)感均勻、易切出完整的組織片、易展片，留片后膠水在玻片上容易用水洗凈，同時組織不易脫落。制成免疫熒光片后用熒光顯微鏡檢查(最好在染色當(dāng)天即作鏡檢，以防熒光消退，影響結(jié)果)，免疫熒光著色不受影響，背景染色、陽性強(qiáng)度及陽性檢出率，與用OCT包埋劑包埋的冰凍切片制成的免疫熒光片相比較效果無異。(見圖1、圖2)

圖1 膠水包埋冰凍切片，直接免疫熒光檢查

圖2 OCT包埋冰凍切片，直接免疫熒光檢查

3 討論

腎活檢標(biāo)本的免疫熒光檢查對腎臟疾病病理診斷起重要的輔助作用，而免疫熒光檢查中標(biāo)本的抗原的鑒定和定位直接影響腎臟疾病病理診斷。因此標(biāo)本制作的好壞直接影響到檢測的結(jié)果。在制作標(biāo)本過程中應(yīng)力求保持抗原的完整性，并在染色、洗滌和封埋過程中不發(fā)生溶解和變性，也不擴(kuò)散至鄰近細(xì)胞或組織間隙中去。冰凍切片的原理是用物理方法低溫冰凍被包埋劑包埋的組織塊后再切片制片，包埋劑本身與組織不會有任何化學(xué)反應(yīng)，包埋劑不會破壞抗原的完整性，不會引起抗原發(fā)生溶解和變性。用包埋劑將組織塊包埋，在低溫下迅速凝凍后能對組織塊起支托固定的作用，達(dá)到容易切片的目的。質(zhì)量好的包埋劑(OCT)凝凍時間短，切片時質(zhì)感滑脆均勻，易切片、展片，易用清水洗去。質(zhì)量差的包埋劑(OCT)，包埋組織塊時凝凍時間長，切片時包埋劑發(fā)硬，不易切片、展片、不易用清水洗去，易使組織脫落。通過反復(fù)實驗和臨床應(yīng)用后，認(rèn)為普通膠水代替OCT包埋來制作冰凍切片用于直接免疫熒光檢查效果完全與用OCT包埋劑所制切片無異(質(zhì)量好的包埋劑)。普通膠水價格便宜，容易購買，進(jìn)口OCT價格昂貴，同規(guī)格相比，后者價格是前者的上百倍。用膠水代替OCT包埋腎活檢組織來制作冰凍切片用于直接免疫熒光檢查，大大降低了成本，本方法值得推廣。