芽胞桿菌組合BCL-8對番茄的促生防病效果及其促生機制初探

陶 晶, 李 暉, 李 春,2*

(1.石河子大學農學院/新疆兵團化工綠色過程重點實驗室,石河子 832003;2.北京理工大學生命科學與技術學院生物工程系,北京 100081)

在長期的研究和生產實踐中,人們發現在植物根際存在著許多對作物病害有良好控制效果的微生物,有些根際微生物還具有促進植株生長和提高營養利用率的作用[1-3]。然而受生物及非生物因素的影響,單種生防菌在復雜的根圍及土壤條件下防病效果通常不太穩定,而且很多生防功能不是單株生防菌能完成的,必須依靠兩種或兩種以上的微生物共同完成,借助多種微生物的復合作用創造一個有利于寄主而不利于病害發展的生態環境,以更好地實現綜合防治[4-5]。因此,利用生防菌的混合菌劑防治植物病害,挖掘并利用其功能已成了植物病害生物防治的研究熱點[6-8]。本研究以具有顯著促生功能的芽胞桿菌SL-44[9]與具有顯著抗病效果的芽胞桿菌SL-13和SL-14[10]復配而成的組合BCL-8為對象,研究了其促生防病效果并初步探索了其促生機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株及植物品種

單一芽胞桿菌SL-13、SL-14和SL-44均為新疆兵團化工綠色過程重點實驗室自新疆特殊生態環境下分離篩選獲得,這3株芽胞桿菌以2∶1∶2的比例組合為BCL-8。植物病原真菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)自番茄病株根部分離純化獲得。植物品種為新疆加工番茄主栽品種里格爾87-5。

1.1.2 培養基

薩氏葡萄糖培養基(SDAY)[11]作為種子培養基擴繁和傳代培養芽胞桿菌,馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基[12](PDA)用于室內培養病原菌立枯絲核菌,麥麩培養基(麥麩與水的體積比為1∶1,每kg麥麩中含葡萄糖20 g,121℃滅菌60 min)用于立枯絲核菌的擴繁。

1.2 芽胞桿菌組合BCL-8促生防病效果的測定

分別用芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株的發酵液(含菌量1011cfu/mL)浸泡番茄種子12 h,晾干后均勻置于鋪有3層潤濕滅菌濾紙的托盤內,于25℃下培養。每24 h記錄發芽數,6 d后分別測量各處理的芽長、根長及鮮重,以滅菌培養液浸種為對照,每處理重復5次。

病原菌立枯絲核菌用麥麩培養基擴繁,接種培養5～7 d后與滅菌土以1∶8的體積比充分混勻裝入營養缽中。分別用芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株的發酵液(含菌量1011cfu/mL)浸泡番茄種子,浸泡12 h晾干后均勻播入營養缽中,每缽20粒種子,每處理重復5次,設3個對照,CK 1:滅菌培養液浸種,土壤接種絲核菌;CK2:滅菌培養液浸種,土壤為滅菌土;CK 3:用種子重量0.8%的化學農藥五氯硝基苯(簡稱PCNB,70%粉劑)拌種,土壤接種絲核菌。定期澆水,種子出苗后15 d調查出苗率和發病情況。播種35 d后測各處理的植株株高、鮮重和干重。

發病率=(發病株數/調查總株數)×100%,病情指數=[(各級發病株數×各自級數的總和)/(最高發病級數 ×調查總株數)]×100,防治效果=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數×100%。

試驗數據用Excel 2003和SAS(v8)軟件分析,Excel 2003軟件作圖。

1.3 芽胞桿菌組合BCL-8的促生機制

1.3.1 發芽種子蛋白酶的測定

種子處理同1.2,稱取2 g處理過的番茄種子,用20 mL磷酸緩沖液冰浴研磨,8 000 g冷凍離心15 min后上清液即為蛋白酶粗提液,將粗酶液在沸水浴中處理5 min使酶失活作為對照。采用福林-酚試劑法[13],于721分光光度計測定 A680的吸光度值,從酪氨酸標準曲線中找出相應的酪氨酸的微摩爾數,蛋白酶活力以水解產生的酪氨酸含量來表示,每處理重復3次。

1.3.2 發芽種子α-淀粉酶和β-淀粉酶的測定

種子處理同1.2,種子萌發3 d后每處理參照李合生[13]的方法,活性測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法,于721分光光度計測定A540的吸光度值,根據吸光值在麥芽糖標準曲線上查出相應的麥芽糖含量(mg),分別計算出總淀粉酶活性和α-淀粉酶活性,最后算出β-淀粉酶活性大小,用mg/(g·min)表示,每處理重復3次。

1.3.3 電導法測定種子的活力

每處理選取大小一致且無機械損傷的番茄種子20粒,分別裝入加有10 mL BCL-8及其單一菌株菌懸液(濃度為1011cfu/mL)的三角瓶里,對照瓶加入10 mL雙蒸水,于25℃浸泡。測定零時刻浸泡液的電導率作為初始值(a1),浸泡 8 h后(種子充分吸脹),測定浸泡液的電導率(a2)。然后將種子及其浸泡液置于 100℃水浴中煮沸60 min,取出冷卻至25℃,測煮沸后種子浸泡液的電導率(a3),每處理重復3次。

種子的相對電導率(%)=(a2-a1)×100/(a3-a1)[14]。

2 結果與分析

2.1 芽胞桿菌組合BCL-8對番茄的促生防病效果

室內測定了芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株對番茄發芽的促生效果(表1)。結果表明,各處理都可促進番茄幼芽的生長。芽胞桿菌組合BCL-8可提前1 d發芽,經其處理的芽鮮重比對照增加了37.5%,平均根長和芽長分別比對照高69.89%和27.05%,根芽比也高于對照,更有利于植株后期健康生長。

表1 芽胞桿菌組合BCL-8對番茄發芽的促生效果1)

芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株對苗期番茄的室內抗病效果見表2,從表中數據可以看出當病原菌番茄立枯絲核菌存在時,組合BCL-8及其單一菌株都能提高番茄種子的出苗率,促進番茄苗期的生長,又可顯著抑制病原菌,降低番茄苗期立枯病的發病率。組合BCL-8的促生防病效果尤其顯著,其出苗率、株高、鮮重和干重分別比 CK 1高 21.67%、117.08%、125.74%和140.51%,對番茄立枯病的防治效果可達58.62%,而PCNB的防效僅為12.62%。由此可見,芽胞桿菌組合BCL-8具有促生和防病雙重功效。

表2 芽胞桿菌組合BCL-8對番茄苗期促生防病效果的測定1)

2.2 芽胞桿菌組合BCL-8對種子發芽的促生機制

2.2.1發芽種子蛋白酶的活性變化

發芽種子蛋白酶活性的測定結果如圖1。由圖可知,經芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株處理過的番茄種子蛋白酶活性高于未處理過的種子,組合BCL-8處理的蛋白酶活性比對照高299.91%,其中SL-14處理的蛋白酶活性最高,比對照高479.87%。可見這些芽胞桿菌有助于增強種子活力。

圖1 番茄發芽種子蛋白酶活性的比較

2.2.2 發芽種子α-和β-淀粉酶的活性變化

發芽種子α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的測定結果如圖2(a)和(b)。由圖可知,經芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株處理的番茄種子α-淀粉酶活性均高于未處理的種子,β-淀粉酶活性除SL-14菌株處理之外也都高于對照。芽胞桿菌組合BCL-8處理的種子α-淀粉酶和β-淀粉酶活性分別比對照高96.74%和99.98%;其中SL-14處理的種子α-淀粉酶活性最高,比對照高483.70%,SL-13處理的種子α-淀粉酶活性最高,比對照高146.15%。可見,芽胞桿菌處理番茄種子后,種子中淀粉轉化為糖類物質的能力得到加強,種子萌發能力增強。

2.2.3 電導法測定種子的活力

當種子發生劣變時,其胞內物質外滲,導致其電導率的升高,從而使種子活力降低。本試驗結果表明(見圖3),用芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株處理的番茄種子的電導率都比對照低。組合BCL-8處理的種子電導率比對照低10.02%,其中SL-44處理的種子電導率比對照低10.55%。可見,這些芽胞桿菌具有保持種子活力的作用。

3 討論

本研究對芽胞桿菌組合BCL-8和單一菌株的促生抗病效果進行了比較研究。芽胞桿菌組合BCL-8及其單一菌株處理均可促進種子發芽。芽胞桿菌組合BCL-8對苗期的促生抗病作用較單一菌株顯著。組合BCL-8處理后,番茄種子發芽率提高了12.5%,出苗率提高了41.92%,對番茄立枯病的防治效果達58.62%,這在實際生產中是很有應用價值的。經組合BCL-8及單一菌株處理過的番茄種子,其蛋白酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性高于對照,而電導率低于對照。蛋白酶在種子萌發過程中能催化蛋白質水解為氨基酸以供種子發育;α-淀粉酶和β-淀粉酶能夠促進種子中的淀粉轉換成糖類等能源物質供種子萌發過程使用;當植物受逆境影響的時候,細胞膜受到破壞,膜透性增大,細胞內的電解質外滲,導致植物細胞浸提液的電導率增大,即電導率越高,種子活力越小。綜上所述,芽胞桿菌對種子發芽的促生機制,可能是不同芽胞桿菌的作用機制不同,產生的代謝物質也不同,通過不同途徑增加了營養物質的積累,提高了機體對有機物質的利用率;其次,可能是不同微生物之間存在協同增效作用,協同抑制或減少病原菌的發生或繁衍,從而增強了植株的生長勢[15]。

盡管根際微生物的防病促生作用已成功地得到應用,但關于其作用機制至今還不很清楚。本研究以體外抑菌試驗篩選得到的具有顯著促生抗病作用的細菌組合為基礎,對促生生防菌的促生抗病機制進行了初步探索。在植物病害的生物防治中,將防病作用與促生作用相結合,可以相互促進,得到更加理想的效果。因此,在實踐中應考慮把兩種功能有機地結合起來,篩選出既有防病作用又有促生作用的生防菌株,以達到既能防治病害又可促進植物生長的目的。芽胞桿菌組合BCL-8顯著的促生抗病效果可能還存在其他促生抗病機制,尤其是多個菌株復配之后的協同增效機理十分復雜,還需進行更深入的研究工作,以闡明其作用機制。

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