水稻白葉枯病菌在離體培養條件下生物膜形成的檢測

傅本重, 吳茂森, 陳華民, 何晨陽

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

生物膜是細菌通過胞外基質(多糖、蛋白質、脂肪和核酸等)聚集附著于生物或非生物表面、結構復雜的群落[1]。無論是在自然環境還是在人工條件下,許多細菌主要以生物膜形式存活[2]。細菌生物膜不僅可引起嚴重的經濟和健康問題(如對抗生素抗性和生物污染等)[3],而且它還是一個重要的致病因子,在人類致病菌以及植物-病原物互作中具有毒性作用的功能[4-5]。如植物病原細菌柑橘潰瘍病菌和苛養木桿菌生物膜形成在其定殖和病害循環中起重要的作用[6-7]。

水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)是一種世界范圍內引起水稻嚴重病害的病原細菌[8]。長期以來,人們一直致力于Xoo生物學性狀的研究,但有關其生物膜的研究鮮有報道。為了闡明Xoo在人工離體培養條件下生物膜形成及其影響因素,本研究分析了不同培養條件對Xoo生物膜形成的影響,利用結晶紫染色快速測試法,測定了Xoo不同菌株的生物膜形成能力。本研究結果不僅建立適合于Xoo生物膜形成能力的測定方法,而且也為研究Xoo生物膜產生機制及其在致病過程中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和材料

本試驗所用菌株及其來源列于表1。Xoo菌株用M210培養基(酶水解干酪素8 g/L、蔗糖5 g/L、酵母提取物 4 g/L、K 2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H 2 O 0.3 g/L、pH 7.0)在28℃培養;基因缺失突變體和互補菌株的培養加入相應抗生素,使用濃度為慶大霉素(Gm)30μg/mL,壯觀霉素(Sp)40μg/mL。結晶紫購自Amresco公司。96孔聚苯乙烯微量板為Axygen公司產品。

表1 本研究所用菌株來源

1.2 PXO99A在不同培養條件下生物膜形成的測定

挑取Xoo野生型菌株PXO99A的單菌落,接種于M 210,振蕩培養(120 r/min,28℃)至指數生長期(A600=2.0)或平臺期(A600=3.5),進行以下不同培養和測試條件的處理。參照文獻[9]描述的結晶紫染色法進行生物膜測定。每個測試樣品設5個重復,所有試驗重復 3次。

測試材料:取1、2 mL和150μL指數生長期的菌液,分別加入1.5 mL聚丙乙烯離心管、15 mm×150 mm玻璃試管和96孔聚苯乙烯微量板孔中,在28℃靜止24 h后,測試生物膜形成。

生長期:取150μL指數生長期或平臺期的菌液,加入96孔聚苯乙烯微量板孔中,在28℃靜止培養12、18 h和 24 h后,測試生物膜形成。

培養時間:取150μL指數生長期的菌液,加入96孔聚苯乙烯微量板孔中,在 28℃靜止6、8、10 h、12、18、24 h和48 h,測試生物膜形成。

培養溫度:取150μL指數生長期的菌液,加入96孔聚苯乙烯微量板孔中,在18、23、28℃和33℃靜止培養24 h后,測試生物膜形成。

培養基:取 10 mL指數生長期的菌液,離心(5 000 r/min,10 min)收集菌體;加入10 mL新鮮M 210或 LB培養基,重新懸浮細菌;取150μL菌懸液加入96孔聚苯乙烯微量板孔中,在 28℃靜止24 h后,測試生物膜形成。

1.3 Xoo不同野生型、突變體及其互補菌株生物膜形成的測定

挑取新鮮培養的單菌落,接種于M210中,振蕩培養(120 r/min,28℃)至指數生長期(A600=2.0)。取150μL培養菌液加入96孔聚苯乙烯微量板孔中,在23℃靜止培養24 h后,用結晶紫染色法測試其生物膜的形成。每個樣品設5個重復,所有試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 不同培養和測試條件對PXO99A生物膜形成的影響

為了闡明不同材料表面對Xoo菌株PXO99A生物膜形成的影響,本研究首先檢測了病菌在塑料離心管、玻璃試管和96孔聚苯乙烯微量板3種不同材料表面生物膜的產生能力。PXO99A在3種材料表面都能產生生物膜,而在96孔聚苯乙烯板上形成的生物膜明顯而穩定(圖1)。因此,本研究選用96孔聚苯乙烯板進行后續檢測分析。

圖1 PXO99A在不同材料表面生物膜的形成

有報道認為細菌能在聚苯乙烯表面24 h內形成生物膜[5],因此,本研究對PXO99A生物膜形成最佳時間點進行了確定。PXO99A在6 h開始形成非常弱的生物膜,從18 h到48 h能形成較強的生物膜,其中24 h形成能力最強(圖2)。對不同生長期細菌的生物膜測試表明,指數期和平臺生長期細胞靜止培養24 h后都形成明顯的生物膜,指數生長期細胞的生物膜形成能力更強(圖3)。

由于Xoo最適生長溫度為26～28℃,本研究檢測了該生長溫度上下5℃溫度范圍內生物膜的形成情況。結果表明,Xoo在18～33℃均能形成生物膜,其中在23℃時形成能力最強(圖4)。

圖4 不同溫度下的PXO99A生物膜形成

對在M210或LB培養基中生長的Xoo生物膜測試表明,更換新鮮培養基均降低生物膜形成能力,其中更換M210后減弱十分明顯(圖5)。

圖5 不同培養基中PXO99A生物膜的形成

2.2 不同地區的Xoo野生型菌株生物膜形成能力

對前期收集或采集的、來源于南方地區(云南和福建)和北方地區(河北、遼寧和吉林)的 14個Xoo野生型菌株進行了生物膜測定。發現所有測試菌株都能產生生物膜,但各菌株之間的生物膜形成能力存在差異,然而這些差異與地區來源無關(圖6)。

圖6 不同來源的野生型Xoo菌株生物膜形成

2.3 Xoo不同基因缺失突變體及其互補菌株生物膜形成的能力

對前期構建的Xoo基因缺失突變體及其互補菌株[10]的生物膜形成進行了測定(圖7)。與野生型菌株PXO99A相比,鞭毛合成轉錄調控因子基因突變體Δf leQxoo和基體蛋白基因突變體Δf liExoo、與H 2O2降解有關的轉錄調控因子基因突變體Δoxy Rxoo生物膜形成能力均顯著降低,而糖基轉移酶基因突變體Δrbf Cxoo生物膜形成能力明顯增強。所有相應的互補菌株可以不同程度地恢復到與PXO99A相似的表型。

圖7 Xoo不同突變株生物膜形成

3 結論與討論

長期以來,對包括Xoo在內的病原黃單胞菌生物膜研究一直沒有一套標準、規范和準確的快速測定方法,生物膜測試結果模糊,需要的菌液體積較大、試劑多,并且操作不便,容易產生誤差。因此,本研究首先重點分析了不同培養條件(塑料和玻璃表面、培養時間、培養溫度和培養基)對Xoo生物膜形成的影響,發現在聚苯乙烯界面、用M 210培養基、在23℃靜止培養24 h是檢測Xoo生物膜形成的適宜條件,從而為Xoo生物膜形成能力分析提供了一套快速可行的測定方法。有研究表明,適當降低培養溫度利于彎曲桿菌在不銹鋼材料表面的生物膜形成[11],其原因可能是由于生物膜依賴的基因表達增強引起的[12]。培養基對生物膜的影響可能主要是由于提供的營養條件變化引起的。在生長到指數期的細胞培養物中,營養成分大部分已經被消耗,營養受到限制而促進生物膜的形成。更換新鮮培養基后,生物膜形成能力下降。

本研究利用建立起的這一套相對規范的結晶紫染色法,測定了不同地區來源的Xoo野生型菌株、不同基因缺失突變體及其互補菌株的生物膜形成能力。發現所有野生型菌株都能產生生物膜(盡管生物膜形成能力存在一定的差異),這一結果表明生物膜產生在Xoo中是一個比較普遍的生物學性狀。此外,本研究發現Xoo鞭毛合成調控或組成基因f leQxoo、f liExoo和rbf Cxoo以及H 2O2降解調控基因oxy Rxoo的突變都影響生物膜形成。這些基因突變與生物膜形成之間的作用機理尚需深入研究。盡管有許多報道認為生物膜形成是植物病原細菌一個新的致病機制,但是有關 Xoo生物膜在Xoo-水稻互作中的功能尚不清楚,有待進一步研究。

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