左旋鹽酸精氨酸腹腔注射建立輕、重兩種急性胰腺炎模型

許永春 李兆申 龔燕芳 金晶

左旋鹽酸精氨酸腹腔注射建立輕、重兩種急性胰腺炎模型

許永春 李兆申 龔燕芳 金晶

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是發生于胰腺的炎癥性疾病，建立合適的動物模型有助于其研究。目前較多采用逆行膽胰管注射法制備急性壞死性胰腺炎(ANP)模型和腹腔注射雨蛙素制備急性水腫性胰腺炎(AEP)模型。本文采用不同濃度的左旋鹽酸精氨酸腹腔注射建立兩種AP模型，現報告如下。

一、材料和方法

1．動物模型制備：健康雄性SD大鼠60只，體重200～250 g，清潔級，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。按數字表法隨機分為對照組、5%左旋鹽酸精氨酸(5%精氨酸)組和15%精氨酸組，每組20只。左旋鹽酸精氨酸，分析純級，由上海華美生物工程公司提供。實驗前大鼠禁食12 h,自由飲水。精氨酸組大鼠分兩次腹腔注射5%或15%左旋鹽酸精氨酸2.0 mg/g體重，間隔1 h。對照組腹腔注射等容積無菌生理鹽水。注射后6、12、24 h自大鼠股靜脈取血1 ml，分離血清，置-80℃冰箱保存。注射后24 h處死大鼠，取胰腺組織予10%中性甲醛固定。

2．觀察指標：(1)觀察大鼠24 h死亡率。(2)采用酶法(麥芽6糖)檢測血淀粉酶；葡萄糖氧化酶法檢測血糖；化學比色法檢測血鈣；酶法檢測肌酐；速率法檢測GTP。均按HITACHI 7600型全自動生化分析儀(日本)標準規程操作。(3)固定的胰腺標本常規包埋、制片、HE染色，由專業的病理醫師閱片，每張切片觀察20個視野，參考Schmidt等[1]的標準評分。

二、結果

1．死亡率：24 h后，對照組及5%精氨酸組大鼠無死亡，15%精氨酸組死亡6只，死亡率30%。

2．實驗室檢測指標的變化：5%精氨酸組、15%精氨酸組血淀粉酶均較對照組明顯升高(P<0.01)，其中5%精氨酸組升高程度相對較低。5%精氨酸組血糖、血鈣、肌酐及GTP含量與對照組無顯著差異；15%精氨酸組的血糖、肌酐及GTP含量隨時間延長呈上升趨勢，均較對照組顯著升高(P<0.05或P<0.01)，而血鈣含量較對照組顯著降低(P<0.05或P<0.01，表1)。

3．胰腺組織病理學改變：對照組胰腺外觀正常，鏡下未見異常改變。5%精氨酸組胰腺輕度腫脹；鏡下見腺泡和導管基本正常，未見出血壞死，間質水腫明顯，有少至中等量炎細胞浸潤，水腫及炎細胞浸潤分值分別為(1.48±0.39)、(1.53±0.41)分。15%精氨酸組大鼠胰腺明顯腫脹，質硬，見片狀黃色壞死灶，大網膜、腸系膜上見皂化斑，腹腔有中至大量血性腹水；鏡下見胰腺組織大片出血、凝固性壞死及脂肪壞死，壞死區內大量中性白細胞和單核細胞浸潤，血管破裂出血(圖1)，水腫、炎細胞浸潤、出血以及壞死分值分別為(3.35±1.21)、(3.15±1.28)、(2.60±0.83)和(2.75±1.04)分，與5%精氨酸組比較均有顯著差異(P值均<0.01)。

表1 各組大鼠血清淀粉酶、血糖、血鈣、肌酐和GTP含量的變化

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01

圖1假手術組(a)、5%精氨酸組(b)、15%精氨酸組(c)胰腺組織病理改變(HE ×200)

討論理想的AP動物模型應使其發病機制與人相似，重復性好，非侵入性，且簡便、價廉，疾病進程、并發癥、死亡率與人類AP相似，并具有同樣的治療反應[2]。現有的AP動物模型主要包括胰管結扎法、乙硫氨酸飲食法、逆行胰膽管注射法和促胰液分泌法(包括雨蛙素腹腔注射法)，其中膽胰管注射法由Aho等[3]1980年首創，運用較為廣泛，該模型較接近人類胰管梗阻、膽汁反流等病因形成的急性胰腺炎。這些動物模型尚無一種與人類AP發病過程完全一致，僅在某些方面有不同程度的相似性，因而根據不同的研究目的，選擇相應的動物模型。

Tani等[4]首次報道腹腔內注射過量左旋鹽酸精氨酸建立大鼠AP動物模型,其機制是大劑量左旋鹽酸精氨酸抑制胰腺腺泡細胞核酸及蛋白質合成，誘導細胞凋亡和胰腺炎相關蛋白(pancreatitis-associated protein,PAP)基因的表達,從而抑制胰腺腺泡細胞增殖，損傷胰腺組織；此外，左旋鹽酸精氨酸注射入動物體內后轉化形成的NO以及氧自由基、細胞因子等也參與了胰腺的損傷[5-7]。本文結果顯示，5%左旋精氨酸組僅能引起一過性血淀粉酶升高，無其他臟器功能改變，病理檢查僅見胰腺組織水腫，炎細胞浸潤，為AEP的病理表現。注射15%左旋精氨酸有一定的動物死亡率，血淀粉酶、血糖升高，血鈣降低，肝、腎功能損害，病理檢查見胰腺出血壞死，大量炎癥細胞浸潤，出現血性腹水，符合ANP的表現，與重癥急性胰腺炎患者胰腺損傷及臟器功能障礙表現相似。

目前常用的十二指腸閉袢法和逆行性膽胰管注射法等AP建模方法需要對動物進行手術,操作復雜,損傷大；腹腔、靜脈注射蛙皮素誘導的AP病變程度輕、費用高；膽堿乙硫胺酸(CDE)膳食誘導的AP死亡率過高,病理變化程度不一致；而本文采用不同濃度的左旋鹽酸精氨酸大鼠腹腔內注射建立的輕、重兩種AP模型，不用開腹操作，簡單、省時，費用低廉，并且實驗重復性好，結果可靠，適合AP發病機制和治療學的研究。

[1] Schmidt J,Rattner DW，Lewandrowski K,et al．A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.Ann Surg,1992,215:44-56.

[2] Ulrich CD 2nd,Kopras E,Wu Y,et al.Hereditary pancreatitis:epidemiology,molecules,mutations,and models.J Lab Clin Med,2000,136:260-274.

[3] Aho HJ,Koskensalo SML,Nevalainen TJ.Experimental pancreatitis in the rat.Sodium taurocholate-induced acute hemorrhagic pancreatitis.Scane J Gastroenterol,1980,15:411-416.

[4] Tani S,Itoh H,Okabayashi Y,et al.New model of acute necrotizing pancreatitis induced by excessive dose of arginine in rats.Dig Dis Sci,1990,35:367-374.

[5] Rakonczay Z Jr,Hegyi P,Dósa S,et al.A new severe acute necrotizing pancreatitis model induced by L-ornithine in rats.Crit Care Med,2008,36:2117-2127.

[6] Paszt A,Eder K,Szabolcs A,et al.Effects of glucocorticoid agonist and antagonist on the pathogenesis of L-arginine-induced acute pancreatitis in rat.Pancreas,2008,36:369-376.

[7] Ishiwata T,Kudo M, Onda M,et al.Defined localization of nestin-expressing cells in L-arginine-induced acute pancreatitis.Pancreas,2006,32:360-368.

2010-03-12)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.025

全軍醫藥衛生科研基金資助(08MA064)

200433 上海，第二軍醫大學附屬長海醫院消化科(許永春，現在江西省南昌市解放軍第九四醫院消化科)

李兆申，Email:zhsli@81890.net