survivin在結直腸癌中表達及與臨床病理特征的關系

河北北方學院附屬第二醫院普外科(張家口 075100)

魯 蓓 武 欣* 王琳冬△ 王淑強* 范 婕* 左東升* 白美玲* 張林西▲

結直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一。近年來,其發病率有明顯升高、發病年齡提前的趨勢。凋亡是正常體細胞維持自穩的重要保護機制之一。近年來發現,凋亡蛋白家族抑制因子重要成員之一survivin,在成人組織中無表達,而在人類多數惡性腫瘤組織如食管癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌等[1～4]中高表達,并能強烈抑制細胞死亡。本研究采用流式細胞術及免疫組織化學方法檢測結直腸癌(Colorectal carcinoma,CRC)及結直腸正常黏膜中 survivin的表達情況,并分析其表達與結直腸癌各種病理參數之間的關系,探討其在結直腸癌進展和轉移中的作用,為結直腸癌浸潤和轉移的預測、預后判斷提供理論依據。

材料和方法

1 臨床資料 收集河北北方學院醫學院病理學教研室以及河北北方學院附屬第一醫院2005年3月至2006年5月間手術切除的結直腸癌標本 100例,同時選取結直腸癌遠端病理證實組織學正常的黏膜 11例。患者術前均未經過放、化療,且術后病理均確診為腺癌。其中,男性 41例,女性 59例,年齡 30～78歲,平均年齡58.3歲。發生部位:結腸癌46例,直腸癌54例;組織分化程度:高分化腺癌 52例,中分化腺癌 26例,低分化腺癌 11例,粘液腺癌 11例;有淋巴結轉移組 48例,無淋巴結轉移組 52例。連續切片,厚4μm,取 2～3張切片,其中 1張做常規 HE染色,由兩位資深病理醫師進行病理診斷復查。另一張用于免疫組化 S-P法檢測 survivin蛋白表達。同時切40μm厚的組織片 5片,放入10ml的試管中,用于進行流式細胞術檢測。

2 主要試劑 兔抗人survivin多克隆抗體(Santa Crus)、羊抗兔IgG-FITC(Lab vision Neomarkers公司產品)、SP-9000試劑盒及DAB顯示劑等均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

3 流式細胞術檢測 首先制備合格的單細胞懸液,按[5]方法進行。然后進行細胞survivin表達的間接免疫熒光標記:取單細胞懸液 1×106/ml,加入兔抗人COX-2單克隆抗體工作液 0.lml,室溫孵育 30min,加入PBS10ml洗滌一次,棄上清,加入羊抗兔 FITC-IgG二抗工作液 100μl,避光室溫孵育 30min,加入PBS 10ml離心同上,棄上清以除去未結合的熒光二抗,上機檢測前加入PBS 0.1ml經500目銅網過濾后上機檢測。同時設一抗或二抗的本底對照和陰性對照。采用美國Beckman Coulter公司生產的Epics-XL II流式細胞儀進行檢測,應用 Expo 32 ADC軟件進行免疫熒光數據分析。檢測前調整儀器 CV值在 2%以內。

4 survivin蛋白免疫組化 S-P法染色 石蠟切片,常規脫蠟至水。按常規S-P法進行染色,survivin一抗進行 1∶100稀釋。DAB顯色,鏡下觀察顯色結果,待陽性部位出現特異性顯色時,自來水充分沖洗,終止顯色。蘇木素復染,充分水洗,常規梯度酒精脫水,二甲苯透明、中性樹膠封片。以 PBS液代替一抗作為陰性對照,以已知結直腸癌陽性切片作為陽性對照。

5 結果判定(1)由兩位資深病理醫師進行雙盲閱片。survivin陽性反應為胞膜及胞漿的棕黃色染色。綜合染色強度和陽性細胞所占的百分比作為判斷標準[6],在 400倍視野下計數 500個細胞,其中染色深度以多數細胞的呈色反應為準:淺棕色1分,棕黃色2分,深棕色 3分,不著色 0分;再將染色陽性細胞的百分比打分:陰性為0分,陽性細胞≤10%為1分,11%～50%為2分,51%～75%為3分,＞75%為4分,染色強度和陽性百分比的乘積＞3分認定為免疫反應陽性。(2)survivin表達流式細胞術定量分析:以流式細胞儀分析軟件給出的每例樣品的平均熒光強度計算熒光指數(Fluorescenceindex,FI),并以熒光指數表示 survivin基因蛋白表達的強弱,并進行相關的數據分析。FI計算公式為:FI=(樣品基因蛋白表達熒光強度-正常樣品的熒光強度)/正常樣品的熒光強度。

6 統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件進行統計分析。survivin蛋白表達的免疫組化結果進行χ2檢驗。survivin蛋白表達的流式細胞儀檢測結果進行單因素方差分析。當P＜0.05時認為具有顯著統計學差異。

結 果

1 survivin在結腸癌和正常結腸黏膜中的表達及與臨床病理特征的關系 免疫組化顯示survivin的陽性表達為癌細胞胞漿出現明顯棕黃色。11例正常黏膜全部呈陰性;100例結直腸癌中68例呈陽性,陽性率為68.00%;兩組間survivin的表達有明顯差異(P＜0.05)(見表1)。淋巴結轉移組survivin表達陽性率為87.50%(42/48),無轉移組陽性率為50.00%(26/52),無轉移組陽性率顯著低于轉移組(P＜0.05);survivin的表達與結直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤的發生部位以及分化程度無統計學意義(P＞0.05)(見 表2)。

表1 survivin在結腸癌和正常結腸黏膜中的表達[n(%)]

表2 免疫組化檢測survivin表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

表3 流式細胞術檢測survivin表達與臨床病理特征的關系

2 流式細胞術檢測survivin表達與臨床病理特征的關系 FCM結果顯示,survivin在結直腸癌中表達的FI值等于3.25±1.06,其表達明顯高于正常黏膜(FI值=1.00±0.25)。淋巴結轉移組 survivin蛋白表達平均 FI值為3.11±1.19,顯著高于無淋巴結轉移組的2.26±1.38,兩組間存在顯著差別(P＜0.05);高、中、低分化及粘液癌組的survivin蛋白表達平均 FI值分別為3.16±1.39、3.20±1.04、3.32±0.48和3.31±1.06,四組間無顯著差別(P＞0.05)(見表3);正常黏膜組survivin蛋白表達分別與其它各組間存在顯著差異(P＜0.01)(見表4)。survivin蛋白的表達與結直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤的發生部位無統計學意義(P＞0.05)。

表4 流式細胞術檢測 survivin在結腸癌與正常黏膜的表達

討 論

結直腸癌是我國消化道最常見的惡性腫瘤之一,腫瘤浸潤和轉移是患者死亡的重要原因。survivin蛋白除與抑制凋亡和保護細胞存活外,還參與腫瘤血管形成,對腫瘤的浸潤、轉移等有關。1997年Sheehan等[7]從人類基因組文庫中通過雜交篩選獲得。survivin是凋亡抑制基因,屬于凋亡蛋白抑制家族,它定位于染色體 17q25,是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中最小的成員。一般而言,survivin除了在胚胎和胸腺中有微弱表達外,其他組織均未檢測到,但 survivin在幾乎所有的人類癌組織中都有表達。survivin在腫瘤細胞的定位不同,功能不同。位于胞漿中主要與凋亡有關,而位于核中的survivin多與腫瘤細胞的增殖有關[8,9]。本研究應用免疫組化檢測發現,其主要位于細胞漿中,而細胞核沒有明顯表達。說明其在結腸癌發生及進展中可能主要起到抑制凋亡的作用。

survivin作為近年來發現的一個重要凋亡抑制因子,它在結直腸癌的生長與轉移中可能發揮著重要作用。survivin可以調節線粒體內膜電壓依賴的離子通道,減少釋放細胞色素C;還可以直接與caspase-3和caspase-7相結合,使caspase的活性降低而抑制凋亡。研究發現,survivin在食管癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中呈高表達,與多種惡性腫瘤的發生密切相關。本研究發現,survivin在結直腸癌中68.00%陽性表達,而正常結直腸黏膜中無survivin表達,這與Kawasaki等[10]研究結果相一致;同時流式檢測結果也說明在結腸癌中其表達顯著高于正常黏膜。提示 survivin可能在結直腸癌的發生或進展中有重要意義。

survivin的表達與腫瘤的淋巴結轉移密切相關。從本研究免疫組化結果可以看出,有淋巴結轉移組的陽性率顯著高于無淋巴結轉移組;但是與患者的性別、年齡、癌發部位及分化程度等無關。FCM結果也顯示,淋巴結轉移組survivin蛋白表達平均 FI值顯著高于無轉移組,與免疫組化結果相一致。提示survivin高表達的結直腸癌更易發生淋巴結轉移,患者可能預后較差。而且,高、中、低分化及粘液癌組的survivin蛋白表達平均 FI值分別為3.16±1.39、3.20±1.04、3.32±0.48和3.31±1.06,組間無顯著差別;但是正常黏膜組survivin蛋白表達平均 FI值僅為1.00±0.25。提示survivin的高表達可能是發生于結直腸癌發生的早期階段。

FCM檢測結直腸癌標本中survivin的表達,所得結果與免疫組化方法的結果相一致,一方面說明兩種檢測方法都在檢測中比較可靠、方法成熟;另一方面,隨著 FCM技術的推廣,該技術已比較成熟,操作相對簡單、快速且結果比較客觀。FCM在腫瘤研究及臨床檢測等方面表現出更明顯的優越性。

[1] Rosato A,Pivetta M,Parenti A,etal.survivin in esophageal cancer: An accurate prognostic marker for squamous cell carcinoma but not adenocarcinoma[J].Int JCancer,2006,119:1717-1722.

[2] Nassar A,Sex ton D,Cotsonis G,etal.survivin expression in breast carcinoma: correlation with apoptosis and prognosis[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2008,16:221-226.

[3] Ulukus EC,Kargi HA,Sis B,etal.survivin expression in non-small-cell lung carcinomas: correlation with apoptosis and other apoptosis-related proteins,clinicopathologic prognostic factors and prognosis[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2007,15:31-37.

[4] Shariat SF,Ashfaq R,Karakiewicz PI,etal.survivin expression is associated with bladder cancer presence,stage,progression,and mortality[J].Cancer,2007,109:1106-1013.

[5] 張林西,左連富,齊鳳英,等.環氧化酶-2與p53在食管上皮癌變及鱗癌細胞中的表達 [J].腫瘤,2003,23(2):111-114.

[6] 許良中,楊文濤.免疫組織化學反應結果的判斷標準[J].中國癌癥雜志,1996,6:229-231.

[7] Sheehan KM,Sheahan K,O’Donoghue DP,etal.The relationshipbetween cyclooxygenese-2 expression and colorectal cancer[J].JAM A,1999,282:1254-1257.

[8] Dai JD,Lu DC,Lai YR,etal.survivin antisense compound inhibits proliferation and promotes apoptosis in liver cancer cells[J].World JGastroenterol,2005,11:193-199.

[9] 許靜洪,成延萍,魏曉麗,等.Survivin基因和增殖細胞核抗原在大腸癌組織中表達及其意義[J].陜西醫學雜志,2007,36(11):1478-1480.

[10] Kawasaki H,Toyoda M,Shinohara H,etal.Expression of survivin correlates with apoptosis,proliferation,and angiogenesis during human colorectal tumorigenesis[J].Cancer,2001,91:2026-2032.