MMP9特異性錘頭狀真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞侵襲力的抑制作用*

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科(西安 710004)

彭慧霞 尉春艷 陳和瓊△ 吳 靜

子宮內(nèi)膜異位癥(EM)是育齡婦女中常見病,發(fā)病率大約10%～15%,并有逐年升高趨勢(shì),25%～50%的不孕患者有子宮內(nèi)膜異位癥。最新研究表明,基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)可特異性降解ECM的主要成分Ⅰ型膠原,促使異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞植入,在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生機(jī)制中具有重要作用。核酶(Ribozyrne,RZ)是一種具有酶活性的小 RNA分子,能特異性地結(jié)合和切割靶基因的m RNA,從而抑制其表達(dá)。本研究采用核酶技術(shù),構(gòu)建了MMP9基因特異性錘頭狀核酶真核表達(dá)載體,并將其轉(zhuǎn)染 EM基質(zhì)細(xì)胞,抑制其對(duì) EM基質(zhì)細(xì)胞的增殖作用,探討 MMP9基因特異性錘頭狀核酶對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用。

材料和方法

1 材 料(1)組織標(biāo)本來源:選取2008年1月至2008年5月西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的子宮內(nèi)膜異位癥患者 20例,年齡25～35歲。所有患者術(shù)前至少 3個(gè)月無激素用藥史,術(shù)后均經(jīng)病理檢查明確診斷。術(shù)中取患者典型的異位病灶進(jìn)行原代子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞培養(yǎng)。(2)主要材料和儀器:胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司,DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,MMP9蛋白抗體購(gòu)自 Cell signaling公司,pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體、限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)自 TaKaRa公司。

2 方 法(1)設(shè)計(jì)核酶基因:在Genebank中查找 MM P9基因 mRNA序列,采用 RNA structure 4.6軟件對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬分析,按照錘頭狀核酶設(shè)計(jì)原則(Symons模型[1]),人工設(shè)計(jì) MMP9特異性的核酶基因序列。選擇MMP9基因 1200位點(diǎn)的GUU三聯(lián)體為核酶切割位點(diǎn),催化活性中心選擇保守的22個(gè)核苷酸序列,在核酶基因序列兩端分別加上BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。設(shè)計(jì)后的核酶基因序列為:(A):5'GCGGAATTCGA

GGAACACTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACT GTATCCTGGATCCCGC3';(B):5'GCGGGATCCA GGATACAGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGT GTTCCTCGAATTCCGC3'。核酶基因由Invitrogen公司合成,命名為RZ基因。(2)核酶基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建:將載體 pcDNA3.1用 BamH I和EcoR I雙酶切,經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,回收大片段。RZ基因用 BamH I和EcoR I雙酶切,經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.6%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,回收大片段。將pcDNA3.1和RZ基因雙酶切產(chǎn)物加入等體積含有 T 4DNA連接酶的反應(yīng)液,16℃連接 2h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α大腸埃希菌,涂布于含 100 0μg/ml氨芐青霉素鈉的LB平板上,篩選陽性克隆并擴(kuò)增。抽提質(zhì)粒并經(jīng) BamH I和EcoR I雙酶切,2.6%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定,命名為pcDNA3.1-RZ。(3)EM原代基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng):手術(shù)室刮取子宮內(nèi)膜標(biāo)本,超凈臺(tái)內(nèi)剪成約 1mm3后,用6ml 1.25 g/L膠原酶 IV消化 70～90 min,離心后用 D-8900重懸,用 200目和400目篩網(wǎng) 2次過濾后接種于75cm2flask中,2 h后換液,洗去多余的紅細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。(4)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及Western blot檢測(cè):將EM基質(zhì)細(xì)胞分為正常對(duì)照組,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RZ組,具體操作按脂質(zhì)體 Lipofactamine 2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染穩(wěn)定后用Western blot法對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)MMP9蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。(5)細(xì)胞體外侵襲能力測(cè)定:采用 transwell小室法。在下室中加入已培養(yǎng)過細(xì)胞的上清作為誘導(dǎo)劑。上下室間置 PVPF微孔濾膜,膜上鋪Matrigel基質(zhì)膠,37℃放置30min。用不含胎牛血清的DMEM懸浮正常對(duì)照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1-RZ組細(xì)胞,并將其加入對(duì)應(yīng)的小室中,每個(gè)小室 8×104個(gè)。37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。取出小室,拭去膜表面的殘留細(xì)胞,結(jié)晶紫染色30min,光學(xué)顯微鏡下觀察侵襲至膜上的細(xì)胞,每孔計(jì)數(shù) 5個(gè)高倍鏡視野(×100)中的細(xì)胞數(shù)總和,求其平均值。以穿膜細(xì)胞數(shù)目的多少作為評(píng)價(jià)細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)弱的指標(biāo)。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 質(zhì)粒鑒定 運(yùn)用BamHI和EcoRI雙酶切,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.6%的瓊脂糖凝膠電泳30min,可見插入的目的片段約 46bp,與預(yù)期一致(見圖1)。

圖1 核酶基因真核表達(dá)載體的鑒定

2 Western blot檢測(cè) 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RZ的EM基質(zhì)細(xì)胞中 MMP9蛋白的表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(見圖2)。

3 細(xì)胞體外侵襲力 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RZ組細(xì)胞穿過人工膜細(xì)胞數(shù)為25.2±3.4,明顯低于正?？瞻捉M、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組的59.3±4.3和58.6±3.8(P均＜0.05)。

圖2 Westen blot檢測(cè)MMP9蛋白的表達(dá)

討 論

子宮內(nèi)膜異位癥雖然是一種良性病變,但是異位子宮內(nèi)膜具有對(duì)卵巢等盆腔器官和腹膜的黏連、侵襲和轉(zhuǎn)移等類似腫瘤的生物學(xué)行為[2]。近來的研究發(fā)現(xiàn),EM的內(nèi)膜可能通過細(xì)胞外基質(zhì)的作用使異位內(nèi)膜更易于種植和侵襲腹膜及周圍組織?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是鋅依賴性的蛋白酶家族,其家族成員可以降解所有細(xì)胞外基質(zhì)成份,破壞基底膜,排除細(xì)胞種植屏障。MMP9是MMPs家族中分子量最大的明膠酶,能降解細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅳ型、V型膠原和明膠這三種主要成份;并能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的出芽,導(dǎo)致新生血管的形成;同時(shí)可通過與整合素的相互活化而加強(qiáng)細(xì)胞間的黏附作用,從而在子宮內(nèi)膜細(xì)胞的異位黏附、種植和生長(zhǎng)的過程中發(fā)揮重要作用[3,4]。目前研究也證明MM P9蛋白在 EM在位內(nèi)膜的表達(dá)顯著高于正常子宮內(nèi)膜[5]。因此我們推測(cè),如果能抑制 MMP9蛋白的表達(dá),可能能有效抑制子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。核酶是具有酶催化活性的小分子核酸(RNA)。它不僅可以像反義 RNA那樣與mRNA結(jié)合,阻斷其轉(zhuǎn)錄、剪切加工和翻譯復(fù)合體形成等環(huán)節(jié),還能在m RNA中的特異位點(diǎn)將其切割,使其失去生物學(xué)功能。錘頭狀核酶由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于設(shè)計(jì)、合成及轉(zhuǎn)移而受到人們廣泛關(guān)注。錘頭狀核酶由22nt的催化活性中心及2個(gè)互補(bǔ)的側(cè)翼序列構(gòu)成,可特異性識(shí)別并切割 GUX三聯(lián)體(X:C、A、U)。但是,由于靶 RNA存在復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu),并非所有的GUX三聯(lián)體都是理想的切割位點(diǎn)。因此,選擇合適的切割位點(diǎn)是充分發(fā)揮核酶切割效率的關(guān)鍵。選擇理想的靶位點(diǎn)需要考慮:①靶位點(diǎn)所在的序列具有重要的生物學(xué)功能;②選擇的位點(diǎn)及其周圍序列具有高度保守性;③三聯(lián)體應(yīng)位于一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)上,有利于核酶接近底物;④具有高比例的A+U,有利于核酶與底物之間的退火,有利于提高核酶的催化周轉(zhuǎn)率[6]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助法分析MM P9 mRN A的二級(jí)結(jié)構(gòu),依據(jù)以上原則選擇第1200位的GUU三聯(lián)體作為核酶的切割位點(diǎn),設(shè)計(jì)并合成核酶基因,將其插入到 pcDNA3.1中,成功構(gòu)建了針對(duì)MM P9基因的特異性錘頭狀核酶真核表達(dá)載體(pcDNA3.1-RZ)。我們將 pcDNA3.1-RZ轉(zhuǎn)染 EM基質(zhì)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),重組質(zhì)粒可明顯抑制 EM基質(zhì)細(xì)胞中MM P9蛋白的表達(dá),Boyden小室法顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RZ組的EM基質(zhì)細(xì)胞的侵襲力明顯減弱,與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和正常空白組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。因此,我們?cè)O(shè)計(jì)的pcDNA3.1-RZ重組質(zhì)?？捎行懈?EM基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MMP9 mRNA,進(jìn)而抑制 MMP9蛋白的表達(dá),使其失去生物學(xué)活性,從而抑制異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲性生長(zhǎng),為進(jìn)一步的研究提供了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ),為子宮內(nèi)膜異位癥的治療提供了新的思路。

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